ckm3u8
剧情简介
获取一个基因CDS序列(🚔)的方法如下(🔉)： 然(📯)后第一条就是我们需要的(✂)序列信息，点击进去，往(🛴)下拉，直到(😮)看到CDS（如下图） 点击(🔨)CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了(🐀)底色的部分序列便(🎙)是我们需要的序列了(🐚)，可以看到(🐵)这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位(⬜)是TGA终止密码子。选中这段序(🚭)列(🆑)复制即可(🥅)。 由(🎏)于需要PCR整个CDS区域，所以正反向(🏬)引(🚝)物并没有多少选择的余地，甚至可以参(💝)照(🚼)上述原则简单粗(📞)暴的(👣)从正反向各选择22个碱(⛷)基左右(😗)作为引物，例如：! 正向引物序列与(🖖)CDS相同，反向(🐹)引物序列与(👍)CDS互补。另外要注意的是(⏹)写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般(🎹)不会从(🦁)3’到(👴)5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实(💓)也(🌙)是5’到3’。 Primer 5的(🥨)使用 如下(🐒)图，首先点击File->New->DNA Sequence， 然后点击空白处Ctrl V粘(🔗)贴(🐜)我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什(👻)么样(🐻)的序列。 下(📞)面的(😝)依次(🆚)是“反(😱)向序列粘贴”、“互(🛄)补序列(🤝)粘(🍒)贴”“反向互补序列(😒)粘贴”。 点击(✊)左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense 如果对现在的引(🥨)物不满(👫)意，还可(🏙)以点击Edit Primers编辑序列(🧗)，如下图，我们(😜)删除掉(🐌)末尾三个碱基，之(🐏)后需要先点击Analyse，然后(🤟)才能(🐩)点击OK，我们可(📞)以看到正向引物已经从25个碱(👦)基变为22个碱基(💽)了。 最后点击Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可(📦)得到正(🎊)向引物，反(💯)向引(🖐)物Copy之后(👆)粘贴也会自动(🥝)变为5’到3’的序列。所以非常方便。 这样我们PDCD1用于PCR的(🥍)正反向引物就(📢)初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现(😂)在的引(🙏)物(😤)就可以送去(😯)合成了，但是如果你想将其构建(🔁)到载(🐽)体上，那(🦍)么我(🐢)们还要对其进行(❗)进一步的(🧓)加工。 Primer 5的使用 根据不同的目的，可以选(👱)择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化(🛣)（pGEX-4T1、pET-28a）(🏰)、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们(🤓)就以过表达(🕓)载(🌑)体(🏦)pcDNA 3.0为(🗜)例(🥛)进行(🛺)讲(🙏)解。 从质(🆕)粒图谱上(🌿)可以看到多克(🕙)隆(🍡)位(🏍)点有多个酶切位点可(🎑)以选择，那是不是每个位点(🤠)都可(⏳)以用呢？(🌐)当然不是！我(🔁)们要 选择那些PDCD1（或其他目的(🕤)基因）本身没有的酶切(⏰)位点！ 所以我们还需(🤠)要(👄)用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。 还是打开Primer 5，然后(🛵)粘贴CDS序列，点(🤰)击Enzyme，2为(🛴)所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击(👩)即(❄)可到3的框(✨)中，选(🎳)好之后(☕)点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个(❄)酶(🖥)切位点，所以这两个不可(🌴)以选，其他的都可以选(🛶)。 不过一(💃)般选择常用(🔭)好用的最好是实验室就有(🚞)现(🏀)成(⌛)的那(🔸)些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可(👜)以在对引物加上相应的酶(♍)切位点了。 于是(🍺)我们得到如下(🆖)引物：(🛩) 好了(👺)，我们现在(❣)就可以将这些引物送去相(🥫)应公(🤯)司(⛄)合成了。 质粒构建 终于到(👜)正题(🌀)了！ 待引物合(🍊)成之后(🉐)，我们用ddH2O将其稀释到(🍎) 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。 首先我们(👛)P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶(🌀)，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体(⌛)系及反应条件如下图： 模板的获取 PCR完成之(⛏)后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂(🛑)盒回(🍶)收。回收之后将其双酶切，同(🚹)时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶(🚐)切所用的最佳Buffer。 酶切回收之后的片(👁)段进(🏘)行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连(🏛)接酶 ，体系如下：(💉) 现在的T4连接酶基本(🧚)都是快酶，比(🔘)如Thermo的这款声称10 min就(🗻)可以连接(🏞)完(🕤)成，不过我保(🅱)险(🏤)起见，一般(🛡)连(😙)接30 min， 切勿连接过夜！ 连接完成之后便是转化，挑菌(🌋)（(🔯)单克隆），摇菌抽提质粒，送去测(🔼)序就(🦆)OK了！ 提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽(😙)提，Invitrogen的(🐈)TRIzol是比较稳定且广泛应(🦈)用的，当然现在(⛩)一些(😺)国产的(😠)TRIzol类(🚜)产品也能满足大部分情(🤡)况(🈂)下的RNA抽提。 ABOUT TRIzol 注意事项及原理 注意事项： 2、TRIzol试剂具有较强毒(🛶)性，如沾到皮(🛠)肤立刻用大(🍜)量的清洁剂和水冲洗！ 溶液(🤖)配方及(📔)原理： 2、氯仿：氯(🎸)仿可增强TRIzol中(🌥)的8-羟基(😝)喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂(🧔)，加入氯(🌲)仿后离心可(🚡)使(🎅)溶液(🔷)分(🔎)层，上层(🚧)为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋(🎁)白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然(🔱)，弱(🕉)碱性(🈂)（Ph8.0）时DNA留(🐻)在水相(⛪)。 3、异丙醇、无(😰)水(🌫)乙醇、70%乙醇：异丙醇(🖐)和乙醇能(🔦)与水任意比例互溶(🥞)，因此加入异丙醇能够夺(💫)取RNA周围的水(📻)分，使其脱水沉淀。 4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂(😬)，它与RNase的(🙇)活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活(🏾)性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说(🍰)是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他(👃)们身上(📧)，才会(🦓)有最大的美(🐗)。 操作步骤 1、细胞破碎 A、组(🛸)织：(🥫)按1 mL/50~100 mg组织样(⏲)品的比例(😆)向(📓)打散的组(🎧)织块中加入TRIzol试(⏺)剂，样品的体(🔡)积(💰)不能超过(👞)TRIzol体(🏯)积的10%。 如(🕎)果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多(🗒)糖或其他细胞外物质，如(⌚)肌肉(📠)、(📣)脂肪组织或植物的块根等，可(🐩)在2℃~8℃(📹)，12000×g离(🍢)心10 min去除这些物质。 关于TRIzol的用量，Invitrogen官方(😵)说明书中(😚)有建议用量： 2、氯仿(👡)抽提分层 3、用异丙醇使(🀄)RNA沉淀(🏐) 加入与水相等体积的异丙醇(⏮)，室温孵育(🌨)10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远(🚳)离离心机轴心的管底，为无色胶状。 4、(🧦)用乙醇洗涤去除残留的蛋白质(🕌)和无机盐 5、用DEPC水溶解RNA 一般逆转录（也可称作反(😈)转(🐡)录）都(💎)有现成的试剂盒，只要大家按照试剂(🛢)盒的说明书来操作，问题都不大，在(💳)这里我就(⏱)以TAKARA的逆(🚭)转(🍬)录试剂盒(🎃)为例稍加说明。 Random 6 mers 为(🌇)随(🌙)机的6核苷酸引物(💡)，引物(🎇)序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具(🆘)有Hairpin构造(🏡)的RNA。包括rRNA、mRNA、(🎯)tRNA等在内的所有RNA的(🌛)反转录反应都可使用本引物。 Oligo dT Primer 适(💣)用于具有Poly（A）Tail的(🔺)RNA，因(🍨)而特(🏩)异(🤫)性好(🕶)，但因其只结(🛅)合Poly A尾巴，对于较长(🎭)的mRNA，经常不能(🌬)延伸到5'端。（原核生物的(👬)RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生(🔍)物的mRNA等不具有(🥑)Poly（A）Tail）。 两种引物(🗞)可据实际情况使用一种(🌚)，也可同时使用。还有(🐮)一种情况，当只扩增一(🌝)种目的基因(😨)时，也可(🐟)以(🌈)使用Specific Primer（PCR时的下游(🏺)引物）作(🌖)为(📿)反转(💲)录引物。 操(🦐)作步骤 步骤(🕑)简述如下：按照下(🥁)图中1配制溶液(🥝)，然后65℃(🐮)处理后加入3中所配制溶液继(🏺)续后续反(🖤)应即(🚛)可(💱)。 连接产物的转化(🥐) 常用的(🌲)感受态细胞有DH5α、(😥)BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商(🦌)业化(💅)的感受(🥪)态。 ABOUT Transformation 注意事(😗)项(😄) 1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感(✨)受(🤡)态转(👑)化效率最高； 操作步骤(🐗) 1. 取50 μL感受态细胞置于(❗)冰上融化(⏯)； 2. 加入5 μL连接产(🏌)物（质(🎵)粒一般只需用白色枪头(🐕)沾取一下即可），混(😣)匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；(🏮) 3. 42℃水浴中热激90 s，迅速(🅱)置于冰上静(👶)置2 min；(➿) 4. 加入500 μL无菌的LB培养(🌩)基(🚷)（(🕣)不含抗(🚎)生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培(🦆)养1 h，使细胞复苏； 5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右）(🍮)，重悬沉(🕋)淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应(🕶)抗生素(😼)）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质(😙)粒：直接取20 50 μL涂于LB培(🍖)养板(🏃)上(🏷)培养即可。 质粒(😴)的(🔵)小量提取 ABOUT 质(🤪)粒抽提(😥) 实验原(🔒)理(🤴)： 较常用的质粒提取方法(💴)有三种：碱裂解法、煮沸(🦕)法和去污剂（如Triton和SDS）裂(🔊)解(✅)法。前两种方法(🚆)比较剧烈(🍍)，适用于较小的质粒（<15kb）。去(🔲)污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质(🌼)粒（>15kb）(🍯)。 碱裂解法是一种应(😴)用最(🍎)为广泛的制备质粒的方(🐻)法，其原(🏜)理为：当细(🍢)菌暴露于高pH值的强阴(💉)离子洗涤(🥙)剂中(⏬)，会使细胞壁破裂，染色(🍸)体DNA和蛋白质变性，将质粒(♎)DNA释(⭕)放到上清中(🌧)。 由于(🎎)质粒DNA分子比(💧)染色体DNA大得多，且(💰)前(📛)者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和(✋)时间不要太过，当pH值(⏩)恢复到(🍳)中性时，质粒DNA双链就会再次形(👡)成。 在裂解过程中，细菌(😈)蛋白质、破裂的细胞壁(🏸)和变(🚅)性的(🤾)染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫(🌹)酸(🍜)盐（SDS）包盖。 当(😆)用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地(👻)沉淀下来。离心除去(💞)沉淀之后，就可以从上(⏲)清中回收复性的质粒DNA。 本方法(🏠)采用Tiangen小提中量试(🔆)剂盒进行提取(🐪)，其纯化系(🥩)统(🔻)是硅基质吸附材料，其原理(🈷)为(🧞)在(🌬)高盐环境下质粒DNA能够(🍋)结合到硅基(🕧)质上，再(🤸)通过去蛋白(🥒)液和漂(🈲)洗液将(📕)杂质和其它细(🍿)菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水(👨)将质粒DNA从硅基质上洗脱下来(🏂)。得(⏯)到的质粒可以用于酶(🌓)切、PCR、(🌲)测(⛪)序、细(✌)菌(📕)转化、转染等分子生物学实验。 实(📀)验试剂（(⏬)试剂盒试剂配方不清楚，以下配方(🆕)见《分子(🚆)克隆实验指南》）(🗝) 1、溶液(🖤)P1：50 mM葡萄糖(🌜)，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A 原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖(⤴)可(🎐)以使悬浮后的大肠杆菌(😸)不(🤗)会快速沉积到管子的底部；(🗣)而EDTA 作为(💱)Ca2 和Mg2 等二价金属(🅰)离子(🐺)的螯合(🍟)剂，起到了抑制DNase的作用；(⬇)RNase作用为去除(🌕)质粒中混有的RNA，其不(🐐)受EDTA的影响。 2、(🤙)溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS 原理：0.2 N NaOH的(🔡)作用在于使细(🚽)菌裂解，而(🍼)SDS作用(🥍)在于加入P3之后(🏛)是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。 3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸 原理：(🍢)这(🚎)一步的K 置换(💫)了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na ，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白(😆)质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子(😚)，钾钠离(🍣)子置换所产生(♌)的(✝)大量沉淀自然就将绝大部(🔡)分(👗)蛋(🏩)白质也(🌷)沉淀了(🚔)，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而(💠)使质粒DNA复性。 操作步骤 1、将过夜培养(🛒)的(✔)菌(⤵)液（5-15ml）(🐇)从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除(🐡)上清。若暂时不提取，可将(⛪)沉淀保(🐠)存(👼)于-20℃，也可直接将(🚏)菌液保存于4℃（短时间）(⌚)。 2、柱(🏠)平衡步骤：向吸附柱中（吸附(🍋)柱放入收集管中）加入500μl的平衡(➿)液(💇)BL, 12000 rpm（-13400g）离(💪)心1 min，倒掉收集管中(🛑)的废液，将吸附柱重新放回收(🌻)集管中（请使用当(🏐)天(🥗)处理过的柱子）。 3、向(🌋)留有(🍫)菌(📨)体沉淀的(🦂)离心管中加入500μl溶液P1（请先检查(💐)是否(⏹)已加(🦂)入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中(🐍)。如果沉淀的菌(🦄)体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用(🚚)量也应(🎩)成比例增加）(🎀)，并分(🕕)到几个管子中分别(💷)进行步骤4和5的操(📕)作（不(🌽)然P1 P2 P3的总(😣)体积超(🤞)过2ml离心(🔉)管容积），步骤(🚸)6过上清时可过同一个吸附柱。 4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和(🔼)地上下翻转(💄)6-8 次使菌体充分裂解(🚾)。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到(🏭)破坏。故加入P2前(👚)将计时(🔷)器定时4 min，以免超过(📣)时间。但(🤜)是(➰)时间也不可过(🖲)短，以(🐓)免(🛤)裂解不彻底。每管操作时间尽量一(👦)致。 5、(😓)向离心管中加入(🚠)700μl溶(💝)液(🎡)P3（记(⛪)得冰上预冷），立即温(🎨)和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后(🛎)12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上(🐥)清转移至新的离心管中，以免(🧓)沉(🦕)淀飘起。 6、(🕑)将上一步收集的上清液(🦌)分次加入吸附柱中（吸附柱放入(😶)收集管中，其(🤕)容量为(🈷)750-800μ(💥)l）,注意尽(🦖)量不(🍾)要(⛪)吸出(🕚)沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集(🖐)管中的废液(🍅)，将吸(💞)附(🎄)柱放入收集管中。 7、可选(🍀)步骤：向吸附(⏰)柱(🕯)中加(🆒)入500ul去蛋白液PD，12000rpm（(🚼)-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废(🐃)液，将吸附柱(👅)重(🚩)新放回收集管中。 8、向吸附柱中加入(👁)600μl漂洗液PW（请先检查是(🚑)否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心(🏥)1 min，倒掉收集(🚓)管中的废液，将(♐)吸附柱放入收集(👲)管中。 9、重复操作步骤8。 10、将吸附柱重新放(🕘)回(🛷)收集管(☕)中置于12000rpm（(💽)-13400g ）离心2 min，目(🥙)的是将吸(🧤)附柱中残余的漂洗液(🌕)去除。 注(🎹)意：漂洗液(🕍)中乙醇的残留会影响后续的(✋)酶反应（酶切、PCR 等）(⏮)实验。为确保下(🚒)游实验不受残(⏺)留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数(👸)min，以(👪)彻(🥊)底晾干吸(🖼)附材料中(🌳)残余的漂(😵)洗液。 11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的(👋)中间部(🕶)位悬空滴加100-300μl洗(🤷)脱缓冲液EB（(👷)65℃预热(🥒)），室温(🤩)放置或65℃水浴2 min，12000rpm（(😪)-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中(🗨)。 注意：为了增加质粒的(⛓)回收效率(🕹)，可将得到的溶液重新(⬛)加入离心吸附柱中．重复步骤 11、洗脱液的pH 值对于(😡)洗脱效率有很大影响。若用水做洗(🔍)脱液(⛷)，应保证其(⚡)pH 值(📺)在7.0-8.5 范围内（可以用(💸)NaOH 将水的pH 值(🔢)调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体(🥤)积(🚘)过小影响回(〰)收效率，但也不(🐱)应过大，以免(💶)所提(🌋)质粒浓度过低，影响后面的(🈷)使(⏬)用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。 结果判断 （2）应该注意的是作为空白(🏢)对照的blank管稀释方法应该(🌤)和所测样品管一样（如样品为2μ(📺)l所提质粒 48μl ddH2O，则blank为2μ(🎂)l洗脱液 48μl ddH2O）。 2、酶切鉴定，并用琼脂糖(💅)凝胶电(💙)泳检测 （2）所提质粒（未酶切）的电泳(🍤)条(🍀)带可能为一条带，也可能为二到(☔)三条带，这(😲)是因(🥐)为质粒(🐽)提取过(😖)程中操作过于(📡)剧烈可能(🆑)使(👻)环状超螺(🥑)旋结构的质粒DNA单链出(🤛)现缺口（保持环(🔶)状，失去超螺旋(🚼)），或双(🚾)链(😫)断裂（变成线状），三(😡)种构型(🚷)的质粒分子在琼脂糖凝(🏈)胶电泳中的迁移(🎐)速率是不一样的，因此会出现多条带(🌗)，这(🦇)也说(🍥)明(⏰)所得质(👞)粒不够理(⚽)想。 测序结果的分析(🗡) 构建好质(⏸)粒之后我们(😠)一般先(🎳)酶切(🥡)鉴定(😓)，鉴定正(🏺)确的可以直接拿去转染(🚥)然后做(🖕)WB检测表达即可。 可以正常表达的质粒我们需要送到测序(🛷)公司测序(😦)，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返(🐬)还(🏛)服务（即送菌液返还他们抽(🔡)提的质粒）。 测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的(👺)通用引物如下： 在公众号内回复“ 通用(🤾)测序(😦)引物 ”获取(👁)此Excel！ 测序结果返回之后我们就可以分析测序结果(📎)了(🧘)。 一般常(🌷)用的序列比对软件有(🦆)DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以(❎)根据个人习惯选择，在这里(🛅)就不一一介(🌗)绍了(🛶)。 DNAMAN 1. 首(🏕)先打开软件，左侧数字为各个通道(🚹)的编号，每个通(🎥)道(🍯)只能(🍜)载入一个序列： 2. 然后(⤵)点击File->New，将(🚎)我们目的基因的CDS序列粘贴进(〰)去，Ctrl A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道(🕟)1。 3. 选择(📱)通道2（点(♑)击(🚿)数(🌲)字2即可），点击File->Open打开(🛰)测序回(❤)来(🎞)的序列信息(🥨)（后缀(🥫)为.seq），同样(😍)全(🌨)选右键载入通道2，之后点击(🚅)Sequence->Multiple Sequence Alignment；(🔧) 4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中(🥥)需要(🐍)比对序列的通道(⛷)，点击(💯)OK即(🛎)可： 5. 后面基本(🌷)是一直(⛑)点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands： 6. 然(🧘)后一(📨)直下一步(🌚)，出来如下结果(🌅)，即可比对(🔙)测序(🎹)结果和(🍳)原CDS序列，如果有突变我们需(🐍)要看一下(👦)是(🛠)否是(🈴)同义突变，如果是即质粒(👦)序列正确。 Chromas 1. 用(🚽)Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File->Blast Search: 辐射4-全电台音乐名称一(⭕)览
经典电台
约翰内斯·勃拉姆(🔇)斯_ 悲剧序曲81号
费雷德里克(📠)·肖邦 _ 叙事曲(🕕)第1首
弗雷德里克·肖邦 _ 降b大(👢)调夜曲9号第(💢)2首
安(🚼)东尼(🐟)德沃夏克(🍵) _ 新世界交响曲
爱德(🛬)华·格里格(🎀) _ 在山魔王的宫殿
弗朗兹·李斯(🚞)特 _ 匈(🦆)牙(💲)利狂想曲第2首
古斯(😏)塔夫(🥢)·(😄)霍(🐺)尔斯特 _ 行(😹)星组曲之火星
尼古(💟)拉·里姆斯基-科萨科夫 _ 天(👨)方夜谭
卡(🚝)米尔·圣桑 _ 动物狂欢节之大(🍪)象(🖇)、天鹅
理(👈)查德·(🏻)施特(🏃)劳(🆙)斯 _ 苏鲁支语录
小约(📲)翰·(🛳)施特劳斯 _ 蓝色多瑙河
伊戈尔·斯特拉文斯基 - 彼(🎀)得鲁(✏)什卡
彼得(🤟)·(🖊)伊里奇·柴可(😔)夫斯基(🔅) _ 斯拉夫进行曲
理查德·瓦(❄)格纳 _ 女(🔛)武神之骑
木兰(🌽)花(🐎)唱(❌)的歌
2015年Lynda Carter, John Davis, Kerry Marx被特邀为辐射4联袂(😺)做的5首歌曲(👟)
Baby It’(🛑)s Just You
Good Neighbor
I’(📡)m the One You’re Looking for
Man Enough
Train Train
钻石(🤞)城电(🐬)台(🔔)
Tex Beneke - A Wonderful Guy
1949年 威廉姆森音乐 发行
Bing Crosby - Ac-Cent-Tchu-Ate the Positive
1944年 哈尔温音乐 发行(🙆)
Cole Porter - Anything Goes
1934年 华纳(😊)音乐(🏢)复刻发行 索尼音乐授权
The Five Stars - Atom Bomb Baby
1957年 彭(🕹)智音乐发行 环球音乐(🍱)授权
Roy Brown - Butcher Pete (Part 1)
1949年 布朗天使(🦖)出(🕉)版社、福特诺克斯(😐)三重奏音乐、(🔡)卡(🖨)琳美国、天穹(🚱)音乐联合发行 华纳(✌)音乐授(❤)权
The Andrew Sisters, Danny Kaye _ Civilization (Bongo, Bongo, Bongo)
1947年 配偶音(👔)乐、音(🚟)销集(👘)团联(✅)合复(🔘)刻(🚺)发行 环球音乐授(🌁)权
Sheldon Allman _ Crawl Out Through TheFallout
1960年 埃文(💯)音乐发行
Billie Holiday - Crazy He Calls Me
1949年 音销集团发(🎉)行 环球音乐授权
Bob Crosby, The Bobcats _ Dear Hearts and Gentle People
1949年配偶音乐、(🧓)法因音乐联合发行
Billie Holiday _ Easy Living
1937年 流(🚷)行音乐发(🏰)行 索尼音乐授权
Roy Brown _ God Rockin’(💀) Tonight
1948年 布(🕶)朗天使发行
Wynonie Harris _ Grandma Plays the Numbers
1949年 三重奏音乐(🕹)发(🚬)行 福特诺(🎒)克(🚈)斯音(💥)乐、卡琳美国联合授权
Bob Crosby, The Bobcats _ Happy Times
1949年 华纳兄弟复刻发行
Betty Hutton _ He’(🕥)s a Demon, He’s a Devil,He’s a Doll
1951年 强人四杰音乐发(🧘)行
The Ink Spots _ I Don’(🤠)t Want to Set theWorld on Fire
1940年 艾迪达拉漠司灵音乐、奥(🍫)彻利音(🥙)乐联合发行(🐈) 环球音(🏭)乐(📲)授权
Ella Fitzgerald, The Ink Spots _ Into EachLife Some Rain Must Fall
1944年 环球(🗞)音乐、音销集(💩)团联合发(🥪)行 环球音(🛎)乐授权
Betty Hutton _ It’s a Man
1951年 德尔默尔音乐发行 索尼(🐋)音乐发行
The Ink Spots _ It’s All Over But the Cryin’
1948年 环球(🕹)音乐发行 环球音乐授权
Louis Jordan五人(🐳)组(🤟) _ Keep a Knockin’(But You Can’t Come in)
1939年 环球音乐发行 环球音(🤐)乐授(👉)权
The Ink Spots _ Maybe
1935年 百(🚠)代罗宾斯(💇)管理集团发行 环球音(🍚)乐(⏺)授权(💍)
Roy Brown _ Mighty, Mighty Man
1949年 布(🐊)朗天使、天穹音乐、福特(📻)诺克斯音乐联合发行 华纳(💔)音乐(🕯)授权
Frankie Carle交响乐团(🏯) _ One More Tomorrow
1945年 华纳音乐、斯卡斯代尔音(🚩)乐联合发行 索(🚌)尼音乐授权
Nat KingCole _ Orange Colored Sky
1950年 艾米迪音乐发(✝)行 环球音(🌤)乐授权
Johnn yMercer _ Personality
1946年(😣) 伯(🍍)恩集(🏍)团、音(🚅)销集团联合复刻发行 环球音乐授权(🍢)
Bing Crosby, The Andrews Sisters _ Pistol Packin’ Mama
1942年 宝丽金国际发行 环球音(🙄)乐授权
Ray Smith _ Right Behind You Baby
1958年 希罗音乐发行 新天地(💚)娱乐授权
Todd Rhodes交响乐(👚)团, Connie Allen _ Rocket 69
1952年(🐝) 三重奏音乐(🌄)、(🔂)福特诺克斯音乐、卡琳(👲)美国联合发行(🛏)
The Dominoes _ Sixty Minute Man
1951年 三重(🐲)奏(🐣)音乐发行 福特诺克斯、(🕘)卡琳美国联合授权
Skeete rDavis _ The End of the World
1962年 音销集团发(🏑)行(😯) 索(📲)尼音乐(😶)授权
Dion _ The Wanderer
1964年 华(💌)纳(🎣)帖木(🥥)儿(⛹)出版集团发(🚆)行环球(🏌)音乐发(🐸)行
Ella Fitzgerald _ Undecided
1938年 环球(🌟)音乐发(🛫)行 环球音(📴)乐授权
Elton Britt_ Uranium Fever
1955 三(📄)重(🤵)奏音乐、阿利音乐、卡琳美(🍝)国联合发行 索尼音(🕡)乐(😪)授权
WarrenSmith _ Uranium Rock
1958年 环球卡德伍兹出版集团发行(🚔) 新天地(🐘)娱乐授权
Bob Crosby,The Bobcats _ Way Back Home
1935年 华(📁)纳(😏)兄弟、主权音乐联(💱)合(♟)发行
Big Maybelle _ Whole Latta Shakin’ Goin’ On
1955 摩纳哥娱乐、蒂龙华莱士联合发行 索尼音乐授权
The Three Suns _ Worry, Worry, Worry
1947年 百代唱(🚬)片发行 索尼音(🤲)乐授权
2020-08-24质(🔫)粒构建
打开NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如(📜)下(➖)图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处(💝)的Search，等(🖍)出来结果之后点击4处(🚽)的“Homo Sapiens”进(🔋)行进一步筛选(🎖)（如果你要做鼠源的就选(〰)Mus musculus，其他(🚒)种属选择(💑)相应的名称即可进一(👯)步筛选了）
虽然可(🛡)以这么简单粗(🚢)暴的设计引物，但是还是想借此教大家使(🥥)用(🐊)一(🕑)下引物设计的经典软件Primer Premier 5。
TRIzol法抽提(🖲)RNA
1、RNA酶（RNase）非常(🔙)稳定，是导(🥝)致RNA降解最主要的物质。它在一些(🚁)极端的条件可(🏌)以暂时失活，但限(🥘)制因素去除后又会迅速(😠)复性。用常(🍿)规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都(🗯)不能使RNase完全失活(😏)。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备(🐪)有关的分(🏫)子生物学实(🎟)验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取(🚿)液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液(🛵)器的内(🍷)部和外部。提(🌪)取RNA时使用专门的RNase-free的(⛄)枪(🎟)头和离心管。
1、TRIzol试剂：(😿)TRIzol能在破碎细胞(🎉)、溶解(🏃)细胞(🦌)内含物的同时保持RNA的完整(⌚)。其主要成分是苯(🚞)酚和异硫氰酸(🏏)胍。苯酚的主要作用是裂解细胞(🦄)，使细胞中的蛋白、核酸物质(🙇)解聚(🐖)得到释放。异硫氰酸(🦂)胍，是一种强力的蛋白质变(🚾)性(🅾)剂，可溶(🏫)解蛋白质(🗝)并(☕)使(✊)蛋白质二(📽)级结构消失，导致细胞结构降(🕯)解，核(🥩)蛋(🥦)白迅速与核酸分离。
B、(📔)贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪(📵)反复吹吸数次。TRIzol试(⛑)剂过少会导致DNA污染。
C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收(🔅)集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物(🕕)或酵(🚝)母）的比例加入TRIzol试剂(🔪)。加入(🍱)TRIzol前(⚡)不要洗细胞，否则易(🅾)造成mRNA的降解。
一般(🦓)情况下，根据细胞(🛸)量的(🌋)多少我(🔽)的(💙)用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅(💟)供(🔹)参考）(📆)
加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵(🐄)育5 min保证核蛋白复合体充(🏵)分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速(📲)不可过高否则会导致RNA断(📜)裂。离心(☕)后液(😋)体分为三层，下层为红色的(🔡)有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的(😱)水(🏆)相。RNA在上层水相中，水相的体积(🍈)约为加入的TRIzol体积的60%。
将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机(🥁)相。
去除上清(🕠)后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配(🚉)制）(🚡)洗涤(🌼)RNA沉淀。震荡混匀(👔)RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
去除(📼)上清后(🗳)，将管(🧢)子敞口晾5~10 min，使(❎)RNA沉淀呈(🏦)现半(🛤)透明状。不要让RNA沉淀变成(🎟)完全不透(🏌)明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解(⬅)。根据后续(💎)实验要求加入适量的DEPC水，用移液(🗃)枪反复(🌉)吹吸数次后。
逆转录法(🚺)合成cDNA
2. 避免反(⭐)复冻(🍥)融(🐇)感受态细(❌)胞(👦)；
3. 整个操(📹)作过程(🔱)要轻柔(🔏)，不要用移液器猛烈吹(⏹)吸(🆗)；
4. 感受态和连接(🛸)产物（或质粒）用量(💞)要(🕯)适中，并(🙋)不是越多越好。
注意：如果(🛤)菌液较多时可(🐎)以通过几(🛏)次(💦)离心将菌体(🕝)沉淀收集到一个离心管中。
注意(💘)：若柱子放置(🥊)较久，需要进行这一步骤(😊)；否则，可(😒)省(🤙)。
注意：菌体量以能够(🚛)充分(🤢)裂解为(⏺)佳，过多的菌体裂解不充分(😄)会降低质粒(⏩)的提取效率。另外，务必彻底(🙁)悬浮细菌沉(🥝)淀，如果(🧥)有未(➰)彻底(🈺)混匀的菌块会影(📧)响裂解，导致提取量和(⛑)纯度(🤶)偏低。
注意(🈯)：温(🕘)和(⛴)地混合不要剧烈震荡，以免污染基因(🍗)组DNA 。此时菌(🍑)液应变得清亮粘稠(♟)，如果未变得清亮，可能由(🗺)于菌体过多，裂解不(😉)彻底，应减少菌体量。
注意(🌱)：P3 加入后应立(😷)即混合(🍽)，避免产生局部(❗)沉淀。如果上清(💋)中还有微小白色沉淀，可再次离(🚸)心(👱)后取上清。
注意(🏞)：如果宿主菌是end A 宿主菌(🤠)（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等）(🔙)，这些宿主菌含有大量的核酸酶，易(⛔)降解质(🅾)粒DNA，推荐采用此步。
如(🧚)果宿主菌是(😼)endA-宿主菌(💰)（DH5α，TOP10等(🐍)），这步省略。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有(🔐)助于更好地去(🌬)除杂(🕉)质。
1、(🥐)使用紫外分光光(🕘)度计对质粒浓度及纯(👟)度进行测定
（1）检测波长为260nm和(🤝)280nm，浓度(🛵)看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯(🔝)度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能(🤢)是蛋白(🚛)质污染，偏(🌊)高则可能(🔛)是DNA降解或RNA污染，如(📍)果洗(🎢)脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离(🥊)子水(👘)，比值会偏低，但(📼)并(🥀)不表示纯度(🥂)低，因为(🐃)pH值(💘)和(🏸)离子存在会影响光吸(👋)收值。另外，测(🚩)出来的OD260和OD280都应(🍋)该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度(🐿)和纯(🎫)度不(🅰)准确。
（1）选用合适(🚊)的内切酶对所提质粒(🥗)进行(🐻)酶切，并与未切质粒及转化用原质粒(🌞)一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶(🌮)切结果(🚈)及所提质粒与原质(🍲)粒(🦀)位置是否一(🧒)致，可以判定所提质粒是(🔴)否为(💰)目的质粒。
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