编辑本段(📅)次要(✊)人物
(🔺) 星炼
人气动漫《吸血鬼骑士》中的人物，同(🔟)其他贵族阶级吸血鬼一样(🐺)隶属于(📈)夜间部，担当玖兰枢的保镖，同早园琉佳一样(💀)平时沉(Ⓜ)默(🐮)寡言，带有(🎡)一些三无少女的色(😑)彩，对锥生(👯)零敌视吸血鬼的(🐓)态度非常的恼怒（(📓)特别是用枪指向玖兰枢时），擅长武(🧐)功(🥖)。
(📤) 夜(🍭)间部：玖兰枢保镖
能力：不(🎷)明 (不过擅长武功啦,很厉害)
CAST：水(🌔)野理纱
星炼出场很少，每次都只露一下小脸(🚹).
夜刈十牙 CV：(✡)安元洋(🔏)贵
吸血鬼猎(🐂)人
零(🔭)的(⏳)师(🍫)父，也是当年(🙀)零的救命(😅)恩人
为保护零因而失去右眼睛，动(🥉)画中这么说而已，漫画可没(🔥)瞎
若叶沙赖 CV：植田佳奈(📡)
日间(💲)部(📟)
(💔) 优姬的(💅)好友和室友
(🦓) 总是像(✉)大姐姐一样照顾优姬。
是个直觉很敏锐的女(📙)孩，在日间部中显(🌰)得与众(🌞)不同
(🛀) (👻)不像日间部的其他女生那样(🕶)迷(👳)恋夜间部的(✈)学生(🕕)
甚至觉得夜间部的(🧞)人有点可怕，对他们敬而远之。
优姬从国中开始的好朋(😓)友，同时是她在阳之寮的室友(🙃)。
拥有看穿优姫烦恼的来源是零或是枢(🥊)的敏锐直觉。很了(⛲)解优姬，被她昵称为“小赖”。
即使知道优姬为吸血鬼后，对她的态度还是一(🎎)样亲切(👌)，没有改(🏄)变。
玖(🤑)兰 树里（玖兰 树里（くらん じゅり，Jyuri Kuran） ）
和(🚌)丈夫"悠"是亲生兄妹，玖兰一族(🖲)为了保留吸血鬼纯血的血脉，兄弟姊妹通婚(🔕)是相当普遍的。
(🌼) 优姬和枢(⛄)的母亲，十年(📗)前(💱)牺(🧛)牲了自己的生(🚼)命而将优姬的(🎺)吸(🏗)血鬼因子封印了起来，利用一个血咒来把(🤣)优姬所有力量及记(🕹)忆封印。
玖兰 悠（玖兰 悠（くらん はるか，Haruka Kuran） ）
和妻子"树里"是亲生兄妹(✡)。
优(🐡)姬和枢(🍙)的(⛪)父(👈)亲，为阻止(✍)李土(🎮)抢夺优姬而(🛍)到地面上战斗，最后被李土所持的吸血鬼猎人专门猎杀(🧘)吸(🐡)血鬼的剑刺中心脏而亡。
玖兰 李土（(🍖)玖兰(⤵) 李土(🈸)（(📣)くらん りど，Rido Kuran） ）
玖(⬇)兰 悠(💱)和树里的兄长(⏬)，支葵千(🖤)里的(🚒)爸(🍒)爸，跟闲(💱)订婚(🎿)的人。
十(🎼)年前(😔)被枢击至重伤，现在附在支葵(🈚)身上，想要优姬作祭(😝)品(💍)复(🏞)活，是(🛥)将枢唤醒的(📬)主(🗼)人，他(👱)利用树里和(🏷)悠他(🍝)们的孩子(🦕)当(🎦)作祭品(🚐)唤醒(🕒)枢，让他(🔸)复活(♿)，其意图目前不明。 在42夜中表明了对(⛰)uk的好感，因为她像树里，李(👷)士喜欢树里。43话中，被零杀死。（属于(😴)龙(🥊)套角色）
白鹭更（(👬)白蕗 更（しらぶき さ(🤬)ら，Sara Shirabuki） ）
跟枢和优姬(💊)一样是纯血种吸血鬼。
枢的朋友。
武器：
狩猎女神：
黑主优姬使用的(🤖)驱魔武器(🎧)，外形为可以自由伸缩的长棍，能够(🌪)利用长的特点进(🧑)行(🏎)高跳；对除了主人以(🏉)外(🦑)的使用者给予电击，长棍顶端似(👉)乎有(🧟)某种类似于印迹(🧗)的东西，对(🎽)Level E似乎有一些杀伤力，与锥生零(🌱)的血蔷薇之枪(❄)的相比威(⏪)力相(👋)差甚远。后期因主人玖兰优姬成为纯血(⏭)种吸血鬼而接(🕒)受了优姬的力(🏁)量(🖖)，进化成为一(🏭)种型似于死(🔵)神(🐷)镰刀的武器，似乎威(🀄)力巨大(🌏)。
血蔷薇(👫)之枪：
锥生零使用的对吸血(🎀)鬼武器，原主人为黑主学院(🦕)的(⏱)理事(🕍)长——(🔧)黑主(♉)灰阎(🚇)；外形(⚾)为(🚅)长枪(⛲)管式手枪，长度大约为普通手枪的一倍，子弹外(❓)形(🦈)为红色(🥞)十字架(💕)，特点是只能够杀死吸血鬼而不(🦌)能够杀(📝)死(〰)人类（(🌁)注：血蔷(😔)薇的名称来自子弹发射(🌕)时的形状）。
血液淀剂：
所(🍧)谓的(🗿)血液淀(⚓)剂就是指吸(🛺)血鬼(🏀)为了暂(💛)时的缓解吸血的冲动而在人类身上抽取血液，然后制成药片状可溶(🖱)于水的固体；(🏼)血液淀剂在(🌫)以吸血鬼为题材的动漫(🍑)中非常的常见，尽(🍞)管血液淀剂可以缓解一时的冲动(🍋)，但毕竟血液淀剂不是鲜血，味道也不(🖲)像新鲜的血液那样好（很像是(🐟)人类(⤵)社会中的(🍟)压缩饼干），而且血液淀剂的(📽)原材料大(💾)部分是从人类的身上抽取（但也有的使用人造血），被抽取血液的人类因流(🍓)失过(🙁)多的血液(📇)而(🕋)发生贫血。
编辑本段黑主学园日、夜间部介绍(🙀)
(🧦)美形的精英集团 － 夜间部的学生其实全都是(👟)吸血鬼，而且是贵族(👪)以上阶级(🧕)，
(🏔)而这项秘密(🎆)绝不能(💟)让日间(🎧)部(🚲)的学生知道。
(📓)所以理事长的养女优姬与零(🍝)担任(😦)保守(🧕)及守护著人类与吸(🗯)血(🌐)鬼的风纪委员
在夜日(🎶)中守护和平的(🅱)学园守护者……
编辑本段内容的(🏁)具体说明
故事(🗣)从(😀)一个寒冷的(📳)雪夜开始。 年幼的(🤽)女孩优姬在(🦅)漫天大雪的月夜里迷了路，意外的撞上了(🛬)那(💵)传(🤹)说中的噩梦代名词——吸血鬼。 生死时刻，男主角之一——玖兰枢出现(🆗)了。当场将恶鬼(🍎)斩杀，救下了女孩，并将她带(🧠)到了黑主(⛹)学园理事长(📽)那里，请求理事(🧀)长的收留照(💫)顾。 十年过去了。当年的小女孩如今(🚆)已是黑主学院普通班一年级的风纪委员。而当(🧠)年救了优(🏿)姬的久兰枢亦是(🐝)黑主学院夜间(🐻)部班长和社长(📂)，同时也是月之舍的舍长(🥤)。 普通班在白天上课，夜间班则在夜晚上课，两个班轮流使用(🛤)校舍；相互间唯一能产生交集的(🚾)机会(😸)只有在傍晚两个(🎿)班交换校舍的时候。 这样的安排是有其原因的(🎰)。因为夜间班(🛺)有一个不为人知(🧑)的秘密，那(📵)就是，夜间班(🌴)的所有成员，都是吸血(🎏)鬼。而受人尊敬的玖兰(🛋)学长，则更是被称(🍚)为“吸血鬼中的吸(🚆)血鬼”的纯(🌽)血种吸血鬼。
(🏈) 吸血(🏙)鬼一族都是以(🖌)幽雅(🏬)，秀(🥏)美，才华出(💓)众的人类形(👴)态出现在世(🐝)间。于是这些(🐻)美艳的吸血鬼少年，就成了普通(😫)班的少女们爱慕的对象。而(⛺)每天傍(🎫)晚的课时交替(🌚)时(👢)分，就不可避免的出(🎺)现女生(🌔)们拥挤在学舍前等(🏉)待吸血鬼少年们的情形。 人类(🐱)与(🕜)吸血鬼的接触，事件(🖖)本身就有着不合适的理由。于是，优姬与另(👦)一位风纪委(🐎)员锥生(🐜)零(🍹)担负起学(🆕)院守护者的职责，处理人类学生与吸血鬼接触时所出(🗨)现的麻(🎻)烦。
(😈) 零的家(🕰)人在四年前被吸血鬼所杀害，而零却奇(🕗)迹般的活了下来，并受到(🤺)了(🚀)理事长的收(🥚)留照顾，在学院里上学。不幸(😶)的往事，使得零的性格变的异常冷(🍑)酷。 对于救过自己(⛏)性命的玖兰学长，优姬心中存着(😯)感激与仰(🌋)慕；而对于身世孤苦的零，优(😀)姬有着长(😔)姐般的关怀(🕚)与(🌉)身世(🕒)相怜的疼(🧡)惜。另(😾)一(🍌)方面，玖兰虽然(📃)对优姬有好感，但似乎迟疑于某种原因，不仅仅是种族间的鸿沟；而零虽对(🍍)优姬也有(🤑)感觉，但迟钝(⛲)的情(⌛)感与坚(✂)硬的内(🈲)心却阻止了他(🥙)的感情。 故事就是在这样的环境中展开(🧑)。
Plot
Vampire Knight primarily takes place in Kurosu/Cross Academy, a prestigious private school with an unusual class structure. The student body is divided into two classes: the Day Class, which is made up of ordinary students, and the Night Class, an elite group of 'beautiful people'. Unbeknownst to the majority of students, and even most of the staff, the Night Class is made up entirely of vampires. The heroine, Yuki, is one of the few humans who know the school's secret. She serves as a Guardian, dedicated to maintaining the peaceful coexistence of the Day and Night Classes with her childhood friend Zero, who lost his parents to vampires at an early age.
编辑本段吸血鬼等(🦒)级分(🥦)划(👣)表(🆖)
把吸血鬼社会以(🐝)金字(🔠)塔来分(🔙)的表格
LEVEL A 纯血种
LEVEL B 贵族阶(🆓)级
LEVEL C 一般吸血鬼
LEVEL D 原(🌓)本(📯)是(📢)人类(👒)的吸血鬼(🔴)
----------------------------------------------------------------
LEVEL E=LEVEL END 位(㊗)于金字塔外， LEVEL D会变成LEVEL E，理(🧓)性逐渐被侵蚀，一步步走向灭亡，由贵族阶级的吸血鬼统管。
编辑本段作品优(❓)点：
1.美型啊...真的是很美型啊!!!
樋野茉(🚑)理老师的漫(🏅)画一直都是很美型的...从最早的"とらわれの身の上"(全5卷,世代的诅咒)到"魔法王(😫)子"(全4卷,可(🐧)爱系)到"WANTED"(1卷3话完!海盗的快乐冒险!就是结束的太快了啊!)
现(📁)在在(🥖)LALA上的热门(🔟)连载"吸(⛰)血鬼骑(🚓)士"...啊!!真的是吸引眼球啊!!有那么(🍣)多美型的(🥦)吸血(😁)鬼...
2.谜样剧情啊...
优(🆚)姬谜样的身世...零身为吸血鬼猎人却成为吸血鬼的内心挣扎和对(❔)血的渴望的矛盾(🌰)及其特殊的体质...纯血族的枢学长对(🧚)优姬特殊的关怀和对零的(🔳)憎恨...3人之(🛴)间的微妙关系...奇特(🤱)的(🍴)理事(🦈)长...文中被第一册完结章(🗼)的一句“我也不知道......原(🌵)来还有其它秘密”给渲染的神秘之极！
(🚞) 悬(💠)念解密：(🏷)
优姬的身份：
现在已经揭开，优姬是玖兰家族的纯血种吸血鬼，是(👬)玖兰(🍩)枢的妹妹兼未婚妻。当(⏭)年，其父母为了不让她被玖(🙈)兰家族的背叛者——玖兰李(🔼)土抓走，牺牲自我性命，把优姬变成了普通人。所以(🏛)才会有这(🔚)么一个故(🛥)事。优姬喝了枢的血，恢复了记忆，知道自己(🐪)是(🤳)一只纯血吸血鬼，也想起了枢就是(🍉)自己的哥哥。
监督佐山圣子(🏵)不算有名,曾在口碑不(🏀)错的《精灵守护者》中担(😠)任过演出，《水星领航员》2季中担任过系(🎌)列构成，担任监督(🏖)的作(💤)品也不多,唯一有点名气(🚪)的作品要数OVA《天使禁猎(🌈)区》了。系列构(👊)成则是出任过去年备受争议的片子《萌少女的(➗)恋爱时光》，《蔷薇少女》、《素描簿》以及(🏮)正在(📿)热播中的《真实之(💽)泪》系列(😿)构(🦒)成的冈(🍼)田磨里，另外他还负责过《水星领航员(👲)》的脚本。人设由实力原(🧤)画(💹)师西(🚽)田亚沙子担任，代表作有著名的(🌚)百合动画《Simoun》、(🚜)《桃华月惮》、《暗与帽子与书之旅人》。
编辑本段制作&声优(STAFF&CAST):
声优阵容(😮)则沿用了之前华丽(📱)到喷血广(🐆)播剧阵容堀江由衣(⬅)、宫野真守、岸尾大辅、福(🔔)山润、千叶进步、保(🧣)志总一朗、(🐚)诹访部顺一等。
CAST
日(🌘)间部：
黑主优(🍌)姬(🐝)：堀江由衣
锥生零：宫(🍝)野真(🏗)守
若叶(🍇)沙赖：水野理(🧕)纱(💸)
日间部班(📪)长(🅰)：松川(🥤)贵弘
新藤抚(🚔)子：藤森多哉
夜间部 ：(🍦)
玖兰枢(📰)：岸尾大辅(🎌)
(👧)一条拓麻：千(💗)叶进步
(🍯) 蓝(📝)堂英：福山润(🐓)
架(⚽)院晓：(👒)诹访部(🤦)顺一
支(🚇)葵千里：保(🦁)志总一(🥛)朗
早园(🔎)瑠佳(🏏)：皆川纯子
(🍷) 远矢莉(🆓)磨(🔚)：喜多村英(🛣)梨(💠)
星炼：(🙍)水野理(👌)纱
红玛利(🌱)亚(🏑)：中原麻衣
其他人物(🔙)：
黑(🏞)主(🐂)灰(🏁)阎：乡田ほづみ(🔼)
夜间(🍱)部教师：松山鹰志
吸血鬼猎人协会会长：菊池正美
(🈵) 夜刈十牙：安元洋贵
一(🔟)条麻(🏨)远：石井(🎢)康(📆)嗣
绯樱闲：折笠富美子
锥生(👺)零の母：浅野ま(➖)ゆみ
(♟)锥生一缕：宫(🌱)野真守
(🌘) (🥓)编辑本段TV目录
(🔽) 01 吸血(💞)鬼之夜 night
02 血的记(😬)忆 memery
03 忏(⛷)悔的獠牙 fang
(😂) 04 定罪的扳机 trigger
05 月下(🙉)的飨宴 sabbath
(🔖) 06 他们(🛶)的选择 crime
07 绯色的(🍠)迷宫 labyrinth
08 叹息(🌂)的(📏)枪声 blast
(🦑)09 红色的(🕑)视(🦖)线 eyes
(⏫) 10 黑(🛷)暗中(🍆)的公主(💜) prisoner
11 愿望的代价 deal
12 纯血的(🤢)誓言 pride
13 深红之锁(🌸) ring
(🏣) 最新消息——(🔀)第二季制作(🆚)决(🍞)定！
由樋野茉莉的人气少女漫画《吸血鬼骑士》改编的TV版动(🛣)画，可以称(🕝)得(🔢)上是(🥐)4月最强(🀄)新(🀄)番(📡)之(⛷)一，在本站的新番人气排(🙏)行榜上，更是PK掉鲁(👎)鲁修(🐖)成为(📀)人气王(🖕)（2008年4月新番人(🔁)气榜）。而在第一季播出的尾声，相关制作方面宣布，将在今年十(👄)月份开始推出它(🐧)的第二季TV动画。另外还将(🥐)从7月7日(🕖)开(🔙)始播出标题为《吸血鬼骑士黑(👈)主学(💔)园放送部》的在线广播，当然宫野真(🙄)守(🍜)、福山润(📮)、岸(📥)尾大介、诹访(😯)部顺一、千叶进(🎹)步和保志总一郎等广播剧及动画版的(⛺)原(📋)声(🐝)优依然阵(🌑)式齐全，一个也不会(😃)少。
第二(😋)季将在十月(🌁)6日推出。
第(🔱)二季(🚜)TV目录
(💅) 1 命中注(🛫)定(🦁)的罪人们 Guilfy
2 永远的(📤)约定(🌜) paradox
3琉璃玉的肖像 Mirage
编辑(🤤)本(🏿)段TV版分集介绍
01 吸血鬼之(🈚)夜
(🕑) 故事从一(🏜)个飘雪的夜晚展开，玖(🕶)兰枢（纯种吸血鬼）(🚢)在雪地里(🥉)救下了遭到吸血鬼袭击的少(🚂)女优姬，把她托付给了的黑主(🆙)学院的理事长黑主灰(⬅)阎，从此与这(❔)个女孩结下(🐳)了不解之缘(🍢)，优(🏣)姬(⏲)的记忆之门也从(🦒)此刻开(🍏)启(👝)。黑主学院(⬆)与其他学院最大的不同就是分为日间部和夜间部，日间部招收的是普通的(🎅)学生(💘)，而夜间部的学生都是(🐒)吸(🌨)血鬼，作为(🧠)风(🈲)纪委员(🏒)的黑主优姬和锥生零，职责就是守(🅰)住(🤤)这(🎳)个秘密不被更(♒)多的人知道，零因为家人被吸血鬼所杀对吸血鬼心存芥蒂。优姬在夜间部巡逻的时候受(🆚)伤遭到吸血鬼的袭(🧐)击，零赶到救了优姬，可是零发现优姬的血对自(😓)己(🤦)来(🔐)说也是难以抵挡的诱惑……
(😒) 02 血之记忆(🌀)
一年一(🦂)度(🥔)的(🥕)圣巧(✡)克力日，女生把巧克力送给喜欢的男(😇)生并表白，日间部的(🦗)女生们都(💦)异常兴(🚾)奋，但是为了防止夜间部吸血(🆒)鬼(🌹)的身份暴露，风纪委员的担(🖖)子反而更重(🏷)了。圣巧克力节当日优(🔱)姬和零尽(🛁)力维持秩序总算没出什么问题，只是零和(🏸)夜(👖)间部(🈲)发生了冲突，身体(🏉)也越来越不受控制。
(🔟) 03 忏悔的(💈)獠牙
优(🧖)姬和零奉命(🕟)对宿(📲)舍进(🗼)行突击检查(☕)，优姬意(🏩)外发现零身上藏有可疑的药品—(📚)—血液(🎬)锭剂，零负气离开黑主学院，优姬也(🌬)跟了出去，结果在半(🉐)路和零走散了，并且遭到吸血(🥊)鬼的袭击，零和枢先后赶到救下了优(👎)姬(⛎)。枢和黑主理(❓)事长的谈(👇)话揭开了零是吸血(🤱)鬼的秘密，与此同(🕞)时零失去理智(🔳)咬了优姬，也暴(🔍)露(🐔)了其吸(⛅)血鬼的(👰)身份……
(✳) (🐫)04 断(📝)罪的诱因
零失去理智咬伤了优姬，黑(👄)主理(🍖)事长不得不(🖇)把真相告诉优姬，枢和理事(🏓)长(🏾)商量准备(🍾)把零转入夜间部。优姬明白零对(🧛)吸血鬼的憎恨，于是一个人跑到夜(💥)间(🚬)部(💡)的宿(💼)舍打算请(😓)求枢撤销决定，结(🗃)果差点遭(💥)到袭击(🍻)。零对咬伤优姬的事深感懊悔，决(🐗)定离开学院(🚭)，优(📽)姬追上去抱住零，阻止了零的离开(🚙)。
05 月下之餐宴
在黑(🛀)主灰阎的传授(🆎)下，优姬(〰)已经(✡)可以使用驯化(😛)术暂(⬅)时控制零，使他不至于变成吸血鬼伤害其他人，因此零可(😖)以继续(🛣)留在日间部。学院内出现的神(🆒)秘老师(🚮)夜(🔕)刈十牙似乎和(👁)零(🌶)有(🤩)着某种牵(🧀)连(😖)，优姬和零(🎮)离(📖)开学(🧞)院办事的路(🎫)上遇到了(🔤)异变的吸血鬼—(💝)—LEVEL-E，反而(🔙)被夜(🏧)间部的(💲)一条所救，为了了解事(🖲)情的原委，两人冒险进入了夜间(🐁)部的月之寮，零(♐)无法忍(🔛)受夜间(🗿)部的气氛离开月之寮，优姬追赶(🔙)上(👢)去发现零无法接受血(👬)液锭剂(🤟)即将异(🚡)变，关键时刻两人掉(🌬)入水中零恢复了理志，这时自称是零(👢)师父(🌴)的十牙突然出现并(㊙)用枪击中(⛔)了零…(📚)…(🥟)
06 他们的选择
十牙用施有(🙌)法术的(📡)子弹射伤了零，并告诉(🔐)优(📋)姬自己是零作为吸血鬼猎人时的师(🕡)傅。第二(🍕)天零没有来日间部上课，优姬从十牙口中得知零被隔离了，为(🍹)了(🕓)减轻零(⏭)的(🤶)痛(🌕)苦，优姬自作主张找到了零，主动让零吸了(🕧)自己的血。伦理课十牙和零都没有来，感到情况异常的优姬冲到零的房间，阻止十牙伤(🔁)害零，十(🐎)牙这才(🦃)告诉她用(🐒)枪射伤零是为(😒)零(🏮)着(🚪)想(🕣)，必须克制他吸(⏸)血的欲望。
07 绯红的迷宫(🎓)
这一(🚻)集(🛹)基(🔷)本是优姬、玖兰和(💪)零三个(🈁)人的回忆，剧情有些零散(🥦)。从优姬被理(👩)事长收(🛰)养开始，然后是零的登场，夜(🐬)间部(🍤)的成立等等(🐗)。
08 叹息的枪(🎩)声
枢因为优姬(🏓)的事情将自己关在房(➗)中，这时一(🍘)条的爷爷突然(🚓)到访…(⏩)…(⛏)零对优(😳)姬一(🏅)直保持着距(💹)离，却接到了猎人协会的任务——(🏦)追捕LEVEL-E，虽然有些勉(👹)强，零还是接受(⏺)了任务，优姬(🚔)在暗中一(❎)路跟随，险些遭(🤭)到(👻)LEVEL-E的袭击，幸(😕)好零(💤)赶到救(🔪)下了优姬。
09 鲜红的视线
(🏕) 夜间部转(🈹)来了(💀)一位神秘插班生红玛(👒)丽亚(🧥)，高贵的气(🔡)质不输给(🌬)枢，但奇怪的个性让其(🐇)他吸血鬼颇感不满。红(⛑)玛丽(💌)亚(🔸)的出现点燃了零(🎥)的复仇之(📫)心，因为红玛丽亚和杀死零(🗽)家人的纯种吸血鬼—(😆)—绯樱闲似乎有着(🏇)紧密(🕉)的联系。
10 黑夜的公主(🥘)
(🕉)期末考试的前(🍋)一(🍸)天晚上，零找到了红玛(🥍)丽亚(🔨)，红玛丽亚毫不(🤼)掩饰地承认自己正是杀害零父母的绯樱闲，但是零却因为身体受到控制无法打(📍)败她，目睹这一事件(🆖)的优姬(🤯)也被(💳)消除了记忆。突(🎸)如其来的(📠)变故让零想(🌙)起了(🕠)多(🤕)年前的(😁)往事(💪)，而失散多(🥞)年(📃)的双(🕟)胞(🙅)胎弟弟一缕居然站在了绯樱闲的身旁。
(🆕)11 愿望的代价
一缕的出现让零(🚳)回忆起(📤)痛苦的过(🕜)去—(⚪)—双胞胎兄弟幼年的往事，原来一缕(🔲)心(🖋)中一直(🧐)充(🤩)满着对家人(🎳)的恨意，于是选择跟随绯樱闲，并决(👵)定向零复仇，十牙在阻止兄弟(🤖)相残的过程中受伤。零和优姬(😋)参加了日间(🚕)部(🙅)与夜间部的联合(📍)舞会，优姬(🐖)也终于下定决心(🖖)接受红玛丽亚的条件，不惜一切代价拯救零。
12 纯血的誓言
(🎅)绯樱闲恢(📖)复了原本的身体，为了挽救零，优姬答应让绯樱闲吸血，绯樱闲也说出(💸)了救零的方(📱)法就(📤)是喝下主人的血。零赶来阻止，不(🎎)希望优姬为自己牺(🐹)牲，并(🐓)用理智摆脱控制(🚓)打伤了绯樱(👼)闲。零和一缕(🧚)正面交锋，一缕说出了憎(⤴)恨(📨)零的理由，与(📨)此同时玖兰枢将绯樱闲杀死(🧘)，但承诺会为(🎍)她完成心愿。
13 深红之锁链
(⚽)绯(🐭)樱闲至死也不(🍞)愿意吸(💁)一缕(🔢)的血，终于伤重身亡，一缕想起和(🌕)绯(🕷)樱闲的回忆难过不已，零告诉一缕(🚲)绯樱闲不吸他的血是为了保护他，伤心欲(💒)绝的一缕离开(🔀)了黑主学院，零也即将沦为LEVEL-E。黑主理事长和十牙用锁链暂时控制(🤓)住了零，但却无法(💅)救他，这时玖兰枢(📏)突然出现，对(➡)零说(🛳)自己的血可以让他恢(🍯)复理智，为(📛)了优姬，零喝下了玖兰(🔶)枢的血液(🥀)，命(🗨)运的轮盘也再(🥒)度开启……
获取一个基因CDS序列的方法(🚗)如下(🍓)：
打开(🚡)NCBI（(🐛) https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在(🐟)2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等(🚹)出来结(👗)果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步(🐜)筛(🐷)选(🕟)（如果你要做鼠源(🎗)的就选(🅾)Mus musculus，其他(🀄)种属选择相应的名(🎾)称即可进一步筛选了(♋)）
然后第一条就是(🕎)我们需要的序列信息，点击进(🖖)去，往下拉，直到看到CDS（如下图）
点击CDS，就出现了下图中所示内容(📃)，其中加了底色的(🤺)部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这(🐪)段(🐝)序列(🏁)开头是ATG起(🥅)始密码(😠)子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即(🏉)可。
由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参(⛽)照上述原则简单粗暴的从正反向各选(🚣)择22个碱基左右作(🌩)为(🤗)引物，例如(📼)：!
正向引物序列与CDS相同，反(🏬)向引物序列(🖌)与CDS互(🍛)补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’(🤾)的方(🏌)向，一般不会从3’到5’，所以我们的(🛠)CDS虽然没有注明方向(📏)，但是其实也是(🏵)5’(⛲)到3’。
虽(♟)然(🔹)可以这(🕠)么简单粗暴的设计引物，但是还是想(🈁)借此教大家使用一下引物设计(🎶)的经典软件Primer Premier 5。
Primer 5的使(📱)用
如下图，首先点击File->New->DNA Sequence，
然(✂)后点击空白处(💜)Ctrl V粘(🔷)贴(🐐)我们(🥞)的(🎲)CDS序列，选择As is，即我(⏭)们复制的是什么样(🏺)的序列(⤵)就粘贴的什么样的序列。
下面的依次是“反向序列(👺)粘(🕹)贴”、“互补序列(🖇)粘(🤟)贴”“反向(👅)互补序列粘贴”。
点击左上(📮)角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense
如(🐺)果(🍿)对现在(🏭)的引物不满意，还可以点击Edit Primers编(🈳)辑序列，如下图，我们删(🏼)除(👂)掉末尾三个碱基，之后(🐌)需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可(😮)以看到正向引(🍿)物已经从(🔍)25个碱(🐢)基变为22个碱(👆)基了。
最后点(🆙)击Edit->Copy->Sense Primer，粘(📢)贴到Word中即可得到正向(💿)引物(🍿)，反向引物Copy之后粘贴也(🚘)会自动变为(🔎)5’到(⛓)3’的序(🗨)列(🈚)。所(🎓)以非常方便。
这(👛)样我们PDCD1用于PCR的正反向引(📎)物就初步设计好了(👒)。如(🏻)果你只是想(🆔)P出PDCD1这个基因，现在(✡)的(👿)引物就可以送去合成(👲)了，但(🙂)是如果你想(📲)将其构建到载体上，那么我们还(🧙)要对其进行进一步的加工。
Primer 5的使用
根据不同的目的(⛷)，可以选择不同的载体，如(🗼)过表达（pcDNA 3.0）(⛱)、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、(⛓)pET-28a）(🔤)、(⏺)病毒(😊)包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们(🛠)就(🔕)以过表达(🏘)载体(🤹)pcDNA 3.0为例进(🌁)行讲(🤣)解。
从质(🚡)粒图谱上可以看(💩)到(🍃)多克隆位点(🔴)有多个酶切位(🌕)点(🌝)可以(🐏)选择，那是不是每个位点都可以用(🚽)呢？当然(🤢)不是！我们要 选择那(📌)些PDCD1（(📰)或其他目的基因(❗)）本身没有(😻)的酶(🗞)切位点！
所(👗)以我们(🌭)还需(🏇)要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的(📴)。
还是打开Primer 5，然(👫)后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克(🐒)隆位点(😯)的酶，双击即(🔷)可到3的框中，选好之后点击(⚫)OK，可以(🔀)看到PDCD1中有ApaI和KpnI两(💞)个酶(🔺)切位(🤛)点，所以这(🍩)两(🌷)个不可以(🛹)选，其他的都可以(🏦)选。
不(🎫)过一般选择常用好用的最好是实验(🍥)室就有现(🏨)成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。
于是我们得到如(🚳)下引物：
好了，我们现(🥡)在就可以将这些引物(🔹)送(🗾)去相应公司合成了。
质粒构建
终(🐗)于到正题(📪)了！
待引(🏭)物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μ(🕳)M 作为母液，取一些稀释到(🎚) 10 μM 做下一步实验了。
首(💰)先我们P出目的(🕢)基因，这一步建议用高保真(📚)PCR酶，我(🥫)常(📜)用的(📺)是 Toyobo公(🐖)司的(🐸)KOD-PLUS-Neo酶 。反应(🕒)体系及反(🍂)应条(🔖)件如下图：
模板的获取
PCR完成(🍌)之后跑1%的(🐼)胶回收目的片段(💓)，也可以直接(📂)用PCR Clean试剂(📥)盒回收。回收之后将其双酶(🚝)切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的(🌲)酶，还可(🐉)以打开网址 http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶(🙆)切所用的最佳Buffer。
酶切(🎧)回收(🈚)之后的片段进(🛺)行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接(🚅)酶 ，体系(🔮)如下：
现在的T4连接酶基本都是快酶，比(😐)如Thermo的这款声称(🥈)10 min就可以连接完成，不过(📣)我保险起(👱)见，一般(😿)连接30 min， 切勿连接过夜！
连接完成之后便(🍽)是转化，挑菌（单(🚛)克隆），摇菌(🏵)抽提质粒，送去测(👏)序就OK了(💦)！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比较(👐)成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比(✏)较稳定且广泛应用的，当然现在一些国(🚓)产的TRIzol类产(🐞)品也能满足大部(🔳)分情况(🌇)下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注(🎧)意事项及(🌷)原理
注意事(🎒)项(🎯)：
1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最(👑)主要的物质。它(🕵)在一(🐠)些(🎫)极端的条件可以暂时失活，但限制因素去(🕧)除后又会迅速复(😏)性。用常规(🎑)的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人(🌳)的皮肤上，因此，在与RNA制备有关(🧛)的分子生(🚎)物学实(🤺)验时，必须戴手套。RNase的又一(👂)污染源是取液(🖌)器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取(👧)液器的内部和(🔫)外部。提取(🔀)RNA时使用(🗻)专门的RNase-free的(🐖)枪头和离心(💮)管。
2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大(🚿)量的清洁剂和(🌞)水冲洗！
溶液配(🏷)方(🎖)及原理(📬)：
1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解(⬆)细胞内含(🐞)物的同时(💧)保持RNA的(💸)完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂(💯)解细(🍵)胞，使细胞中(🐑)的蛋白、核酸物质解聚(👚)得(🤡)到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性(🌗)剂，可溶解蛋白(🏐)质并使蛋白质(🔕)二级结构消失，导(🎍)致细胞(💐)结构(🌿)降解，核(🔹)蛋白迅速与核酸分(😡)离。
2、氯仿：氯仿(📑)可增(🚛)强(🚻)TRIzol中(🏜)的8-羟基喹啉对RNase的抑(⭐)制作用。另(👘)外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上(🎴)层为水相，下(🎂)层为有(😨)机相。苯酚为弱酸性(🔤)，酸性条件下（一般(🌪)为(🤟)Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留(🥖)在水相；反之(🔞)亦然，弱碱性（(🆕)Ph8.0）(🐚)时DNA留在水相。
3、异丙醇、无(🌮)水乙醇、70%乙醇：(🍦)异丙(🏇)醇和乙醇能与水(🍖)任意比例互溶，因(🍓)此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水(💿)：DEPC是(🚛)RNase的化(🦎)学修饰剂，它与RNase的活性(📔)基(🚢)团组氨(📕)酸的咪(😞)唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应(🏓)小心。谁说是最优秀的；谁(😓)是最(☝)自由的，谁也就是最优(📷)秀的，在他们身上，才会(🔽)有最(📣)大的(🧣)美。
操作步骤
1、细胞破碎
A、组织：(🤺)按1 mL/50~100 mg组织样(🌊)品的比例向打(⬛)散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超(🏐)过TRIzol体(💩)积(👅)的10%。
B、贴壁细胞：按(🗾)1 mL/10 cm2的比例直接加入(🙍)TRIzol试剂，并用(🏣)移液(🔩)枪反(🏌)复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污(🔮)染。
C、(🕟)悬浮细胞：悬浮细胞离心(🐠)收集后，直接按1 mL/5~10×(🏻)106个细胞（动物(📸)、植物或酵母）(📳)的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前(🚓)不要洗细胞，否则易造成(👼)mRNA的(🕍)降解(👙)。
如果样品中(🤚)含有(🔽)较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、(🚪)脂(🔊)肪组(🔮)织或植物的块根等，可在2℃~8℃(🚖)，12000×g离心(🥎)10 min去除这(🖲)些物质。
关于(👙)TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量：
一(🧙)般情况(😯)下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅(🔢)供(⏭)参考）
2、氯仿(🚚)抽提分层
加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按(📷)0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加(🏧)入(♑)氯(👇)仿。盖紧管盖后剧烈(😿)摇晃(🏝)15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则(🌊)会(🎮)导致(🐝)RNA断裂。离心后液体分为三层，下层(😽)为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色(🏢)的(🎵)水(📞)相。RNA在上层水相中，水相的(🛀)体(💗)积约为加入的TRIzol体积的60%。
3、用异丙(🆓)醇使RNA沉淀
将上层水相(🦆)转移到一个干净(🈴)的1.5 mL管中，如(🚿)需提取DNA或蛋白(🚋)质就保(💣)存下层有机相。
加入与水相等体积的异丙醇(🔫)，室温孵(🏳)育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一(📃)般(🍑)附着在远离离心(🈲)机(📺)轴心的管底，为无色胶状。
4、用乙醇洗涤去(🚟)除(🚋)残(👎)留的蛋(🍋)白质和无机盐
去除上清(🎛)后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤(⏩)RNA沉淀。震荡(💡)混匀RNA后(🏷)，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、用DEPC水(🙉)溶解RNA
去除上清后(🔳)，将管子(🔌)敞口晾(⏲)5~10 min，使(😽)RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉(🥫)淀(🍿)变(🕰)成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的(🏑)溶解。根据后(🌝)续(🚄)实验(😳)要求(⛩)加入适量的DEPC水(🔍)，用移(🔎)液枪(👵)反复吹吸数(🍅)次后。
逆转录(🤳)法(🙃)合成cDNA
一般逆转录（也可称作反转录）都有现成(〰)的试(🔣)剂盒，只要大家按(🐄)照试剂盒的说明书来(📡)操作，问题都不大，在这(🎇)里我就以TAKARA的逆转录(❗)试剂(🕒)盒为例(🕞)稍(👾)加说明。
Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物(🚘)，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产(🥥)物(🏟)量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括(🍥)rRNA、mRNA、tRNA等在内的所(🌔)有(🐬)RNA的反转录反应都可使(🚿)用本引物。
Oligo dT Primer 适用于具(😡)有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对(🥁)于较长的mRNA，经常不能(🐅)延伸到5'端(⛲)。（原核生(📕)物(🔯)的RNA、真(🕙)核生物的rRNA、tRNA以及某些(💒)种类(🍫)真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
两种引物可据实际情况使用一(🏩)种，也(🌅)可同时使用。还有一种情况，当只扩(⤴)增一种(😳)目的基因时，也可以使(🕣)用Specific Primer（(🐄)PCR时的下游引物）作为反(🆒)转(🦂)录引物。
操作步骤
步骤简述如下(♎)：按照下图中1配(🚡)制溶(🎫)液，然后65℃(⏭)处理后加入3中(🥡)所配制溶液继续后续反应即可。
连接产物的转化
常(🕳)用(🗄)的感受态(🔸)细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用(📬)DH5α，可(🏓)以自己制(🌀)备也(🍁)可以购买商业化的感受态。
ABOUT Transformation
注意事项
1. 感受态细胞要现用现融(🏔)，刚刚融(📕)化的感受态转化效率最高；
2. 避(🍏)免反复冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要(🐼)轻柔，不要用移液器猛烈(📧)吹吸；
4. 感受态和连接产物(🌥)（或质粒）用(🌑)量要适中，并不是越(🍍)多越好。
操(🧥)作步骤
1. 取50 μL感受态细胞置于冰上(🍦)融化；(😕)
2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一(🚩)下即(🙀)可），混匀，置于冰(🍳)上静置30 min（此时应该打开水(🐚)浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于(🚍)冰上静置2 min；
4. 加入500 μL无(📌)菌的LB培养基（不(⛅)含抗生素），混匀(🤕)后置于37℃，200rpm的(🍴)恒温摇床中培(🤨)养1 h，使细胞(🌯)复(🎁)苏；
5. 连(🍸)接产物：3000 rpm离(🚦)心5 min，弃上清，留取(😐)少量LB（50 μL左(🎫)右），重(🐪)悬沉淀，全部均匀涂布于(💯)LB培养板(☝)（需含(😢)相应抗生素）上，37℃(🛁) 倒置培养 16 18h；质粒：直接(👥)取20 50 μ(🥘)L涂于LB培养板上培养即可。
质粒的小量提(🌘)取
ABOUT 质粒抽提
实(🍙)验(🌄)原理：
较常(😈)用的质粒提取方法有三(🍏)种：碱(🚵)裂解(🚨)法(Ⓜ)、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解(🌷)法。前两种(🚇)方(🔓)法比较剧(🍶)烈(🏗)，适用于较小的质粒（<15kb）。去污剂(🥊)裂解(🍈)法则比(🏋)较温和，一(💟)般(📈)用于分(🎸)离(🗳)大质粒（>15kb）。
碱裂解法是(🛳)一种应(🐌)用最为广(🧙)泛的(🔪)制备质粒的方法，其原(👆)理(😫)为：当细菌暴露于高(🌫)pH值的强(🔋)阴离子洗涤(😏)剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质(🍶)粒(🛡)DNA释放到上清中。
由于(🐡)质粒DNA分子比染(🎽)色(🗑)体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为(👕)线状分子(🚰)。只要碱(💔)处理(💺)的(⏳)强度和时间不要太过，当pH值(🛍)恢复到中性时，质粒DNA双(🔞)链就(💰)会再(🧐)次形成。
在裂解过程中，细(🏟)菌蛋白质、破裂的细胞壁和变(🐌)性(⏺)的染色体(📭)DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被(🃏)十二烷(🏊)基硫酸盐（SDS）包盖。
当用钾离子(🤢)取(🥙)代(🚃)钠离子时，这些复合物会从溶液(🐃)中有效地沉淀下来(🍚)。离心除(🏋)去(📠)沉淀之后，就可以(🚗)从上(🚥)清中(⭕)回收复性(🍓)的质粒(🌪)DNA。
本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是(🔝)硅基(👄)质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合(💇)到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液(🍐)将杂质(㊙)和其它细菌成分去除(🍝)，最(🐀)后用低盐缓冲(🎿)液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以(🛂)用于酶切、PCR、测序(🚞)、细菌转(🔬)化、转染等(✌)分(🌼)子生物学实验。
实验试剂（试剂盒试剂配(💊)方不清楚，以下配方见《分(💦)子克隆实(🌲)验指南》）
1、溶液(✌)P1：50 mM葡萄糖(🌃)，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体(🏝)系(🔦)；50 mM葡(〽)萄糖可以使悬浮后的大肠(😨)杆(💈)菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2 和Mg2 等二价金属离(📬)子(🤾)的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作(🎯)用为去除质(💝)粒中混有的RNA，其不受EDTA的(🗒)影响。
2、溶液(💦)P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理(🛌)：0.2 N NaOH的作(🤳)用在于使(🥁)细(🕙)菌裂解，而SDS作用在于加入P3之(🆙)后是被(🌻)其(🔋)包盖(🛸)的细菌(💻)蛋白，染(🌖)色体DNA一起作为沉淀(🕵)析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸
原理(🕖)：这一步的K 置换了SDS（(🏏)十二烷基磺酸钠）中的Na ，得到PDS（十二(📩)烷基(🤴)磺(💭)酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上(🏩)结合一个SDS分(🤝)子，钾(🥊)钠离子置换所产生(🐃)的大量沉(🍨)淀(🐩)自然就将绝大部(😓)分蛋白(🐧)质也沉淀了，同(🤘)时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸(⛏)用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质(🖥)粒DNA复(🧠)性(🧔)。
操作(🥔)步骤
1、将过夜培养(🙀)的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用(🚕)泵尽量吸除(👤)上(🍼)清。若暂时不提(🤯)取，可(🏎)将沉淀保(🚿)存于-20℃，也可直接将(🕡)菌(🕙)液保存于(🥎)4℃（短(🚜)时间）(🌰)。
注意(🏆)：如果菌液较(🛬)多时可以通过几次离心将菌体沉(🗒)淀收集到一个离(👆)心管中。
2、柱平衡步骤：向吸(🐔)附(🌎)柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）(🌾)离心1 min，倒掉收(🥚)集管中的废液，将吸附(🚛)柱重新放回(🏏)收集管中（(🌰)请使用当天处理过的柱子）。
注意：若柱子放置(🚕)较久，需要进行这一步(🥢)骤；(📽)否则，可(🥥)省(🐺)。
3、向(🔆)留有(🔔)菌体沉淀的(🆚)离心管中加入500μl溶(🏥)液(🌯)P1（请(👚)先(🍉)检查是(🔢)否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬(🦔)浮细菌细胞沉淀(🤕)，并移至2ml离心管(♍)中。如果沉(🦉)淀的菌体(🍍)较多，则相应增加P1的用量（之后(🕉)P2和(🗝)P3的用(✳)量也应成比(❤)例增加），并(👋)分到几个管子中(💎)分别进行步骤4和5的操作（不然(🎩)P1 P2 P3的总体积超过(🧒)2ml离心管(👉)容(⬛)积）(🔣)，步骤6过上清(📲)时可过同一(💂)个吸附柱。
注意：菌体量以(📄)能够充(🤣)分裂解(🎊)为佳(💺)，过(❔)多的菌体裂解不充分会(📢)降低(❄)质粒的(🤹)提(👻)取(🚋)效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的(⛺)菌块会影响(😦)裂解，导致提取量和(🐯)纯度偏低(💧)。
4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和(🦗)地(🥑)上下翻转6-8 次使菌体充分裂解(😠)。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加(👄)入P2前将计时器定时4 min，以免(🆘)超过时间(🗃)。但是时间(💃)也不可过短，以免裂解不彻(🐪)底。每管操作(🧠)时间尽量一致。
注意(🦅)：(🚉)温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时(⛺)菌液应变得清亮(🔷)粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5、向离(📎)心管中加入700μl溶液P3（(👝)记得冰上预冷），立即温(🍆)和地上下(🚣)翻转6-8 次，充分混匀，此(🍥)时会出现(📒)白色絮(🍵)状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上(🖌)清量(👆)较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的(🎲)离心管中，以免(✌)沉淀飘起。
注意：P3 加入后应立即(📑)混合，避免产(🆑)生局部沉淀(🔽)。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离(🔸)心(🧒)后(⛑)取上(🛁)清。
6、将(🙈)上一步(🛰)收集的上清液(😞)分次加入(🐶)吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为(🎧)750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液(🌀)，将吸附柱放入收集(🌆)管(🤲)中。
7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿(🔜)主菌是end A 宿主菌（(🦍)TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含(👠)有大量的核酸(👁)酶，易降(😛)解质粒DNA，推荐(🖥)采用此(🔜)步。
如果宿主菌是endA-宿主菌(🈶)（DH5α，TOP10等），这步省略。
8、(🧡)向吸(🚪)附(🛤)柱中(🏭)加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无(💮)水(😫)乙醇），12000rpm（-13400g）离(🌷)心1 min，倒掉收集管中的废液(🎎)，将(🛂)吸附柱放入收集(🚺)管中。
注意(📖)：加入漂洗液PW后，如果室(⬛)温静置2-5 min，有助于更好地(🍯)去除杂质(📣)。
9、重复操(🈷)作步骤8。
10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心(🕳)2 min，目(🌔)的是将吸附柱中残(🐆)余(🦋)的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙(✴)醇的(⛷)残(🕗)留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）(💞)实验。为确保下游(🧔)实验不受残(🈴)留乙醇的(🎉)影响，建议将吸附柱开盖，置于室温(🔆)放(🦄)置(🍘)数(🌁)min，以彻底(🐓)晾干吸(🚡)附材料中残余的漂洗(🥉)液。
11、将吸附柱置于一(📢)个干净(Ⓜ)的离心管(📓)中，向吸附膜的中间部位悬(👘)空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（(🚴)65℃预热），室温放置或65℃水浴(🏸)2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒(🗳)溶液收集到(🎧)离心管中。
注意：(🌠)为了增加质粒(🚦)的回收效率(🖇)，可将得到的溶液重新加(🙉)入离心吸附柱中．重复(🌹)步骤
11、洗(🚏)脱液的pH 值对于(🔷)洗脱效率有很大影响(🙏)。若(🧒)用(💨)水做洗脱液，应保证(👝)其pH 值在7.0-8.5 范围内(🌀)（可以用NaOH 将水的pH 值(🚨)调到此范(🤹)围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗(🎲)脱缓冲(🍐)液体积不应(🏺)少于100μ(😼)l，体积过小影响回收(😌)效率，但也不(🔯)应过大，以(📳)免(🌚)所(♊)提质(🗽)粒浓度过低，影(🧝)响后面的使用。且DNA产物(🎏)应保存(🎋)在-20 ℃(⭐) ，以防DNA 降解。
结果(🗨)判断
1、使(💀)用(🎏)紫外分光(🤔)光度计对质粒浓度及纯度进行测定
（1）检测(🏈)波长为(🔑)260nm和280nm，浓度看(📌)OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯(🏃)度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低(➿)可能是蛋白(🍫)质(🚈)污染，偏高则(🏆)可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因(🐀)为(🎡)pH值(🗞)和离子存在(🐇)会影响光吸收值。另外，测出来(🦆)的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度(🌋)和纯度不准确。
（2）应该注意的(🆔)是作为空白(Ⓜ)对照的blank管稀释方法应该(🐦)和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒(🌀) 48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液 48μl ddH2O）。
2、酶切鉴定，并(😾)用琼脂(🐱)糖凝胶(🎡)电泳(🐊)检测
（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行(🗼)酶切，并与未切质(🗿)粒及(🐏)转化用原质(😨)粒一(🕉)起用琼脂糖凝(💛)胶电泳检测，根据(⛸)酶切结(📚)果及所提(📬)质粒与原(💺)质粒位置是否一致，可以判定所提质粒(🕠)是否为目的质粒。
（2）所(🌛)提质(🆒)粒（未酶切）的电泳条带(🏑)可能(🎵)为一条(💂)带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取(👛)过程中操作过于剧烈可(🚧)能使环(🍿)状超(📡)螺旋结构的(💳)质粒DNA单链出(🛺)现(🍳)缺口（保持环状，失去超(🌽)螺旋），或双链断裂（变成(🦄)线状），三(🛋)种构型的质粒(🧜)分(💭)子在琼脂糖凝胶电泳中(🌔)的迁(🚧)移(🚍)速率(🔠)是不一样的(♿)，因此(🚝)会出现多条带(👑)，这也(🐫)说明(🌥)所(🦑)得质(🎤)粒(🤕)不(🕗)够理想。
测序(🥠)结(🚝)果的(🤴)分析
构建(🕦)好质粒之(😠)后我们(🕜)一般先酶切鉴定，鉴(🌍)定正确的可以直接拿去转(🕖)染然后做WB检测表达(📓)即可。
可以正(🖥)常表达的质粒我们需要(📢)送(😊)到测序公(🤭)司测序(😪)，也可(❕)以直接送菌液测序，有(♑)些测序公司还提供质粒返还服务（即(⬜)送菌液返还他们抽提的质粒）(🐑)。
测序的引物一般使用通用引物，如果(🚏)没有通用引物需要自行设计。常用的通用(🗑)引物如下：
在(🌊)公众(🉑)号内回(🖊)复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！
测序结(👑)果返回之后我们(🐧)就可以(🐚)分(🔛)析测(🛵)序结果了(🍓)。
一般常(🤸)用的(🐋)序列比对软件(🏟)有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大(🚩)家可以(🔛)根据个人习惯选择(♋)，在这里就不一一介绍(🖌)了(🕜)。
DNAMAN
1. 首(🤪)先打开软件，左侧(💊)数字(🚥)为各个通(🍟)道(🕓)的编号，每个通(❎)道(🚒)只能载入一个序列：
2. 然后(🗡)点击File->New，将我们目的基因的CDS序列(👸)粘贴进去(💩)，Ctrl A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列(⚽)载入通道1。
3. 选择(⛩)通道2（点击数字2即可），点击(😛)File->Open打开测序回(🍿)来的序列(🚺)信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；(🔰)
4. 在弹(➿)出窗口中，点击Channel，选(👦)中需要(👕)比对序列的(🎖)通道，点击OK即可(🎓)：(🌒)
5. 后(🐩)面基本是一直点击下(🍕)一步，在(🧟)如下图(🌡)窗口中选中Try both strands：
6. 然后一直(🈚)下(🌍)一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列(🌫)，如果(🌀)有(🎍)突变(🍠)我(⭐)们(🐁)需要看一下是否是同(🥫)义突变，如果(🆔)是即质粒(🐺)序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软(💔)件打开(⛴)测序(🤡)返(🙎)还的序列(🔲)信息，然后点击File->Blast Search: