1号人(🛥)自信、独立、有主见(🕝)、(💙)有想法，他们(🦌)无论遇到什么困难，都敢于冲锋陷入接受挑(🤭)战。
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END
2号(😛)人
2号人温和、(⏩)细(🛸)心，敏感，他们喜欢分析、喜欢和谐，在(🥟)人际相处时永远(📴)是那个最愿意配合别人的人。
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END
3号人(😐)
3号人行动(📻)力强、(🎊)热情、点子(👉)多、创意无限(🍋)，他们(🥐)在生(👄)活中常常能想出各种(💔)好玩的创意，并让这一切呈现在生活(🛁)中，跟他们一样有趣。
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END
4号人
4号人(👦)爱(🔟)学习、策(💼)划规(⚓)划能力强、注重家庭，他们待人真(👙)诚、讲(🏙)究诚信，无论(📕)是工作还是生(♈)活上，非常遵(🆖)守规矩。
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END
5号人
5号人喜欢自由，不喜欢受约束，注重(🤲)感(🔗)觉，喜欢玩，他们不管在外面还是家里，都喜欢用幽默的方式与身边人相处。
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END
6号人
6号人智慧、(👮)追(🍑)求完美、挑剔、喜欢(🐤)讲(🥫)究细节、乐(🔛)于(🕢)奉献(😇)，经常为身边(🚂)的朋友或(🐆)为家人(🌹)做很多的付(🥗)出。
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END
7号人(🤨)
7号人(😘)人缘好，喜欢钻研、(🤭)好奇心强，是一类比(🦗)较(🍺)幸(🎓)运的人(🎿)；他们对未知(⛹)事物或神秘领域(🔮)的知识有不断(🥈)探(🌂)索的(🧝)欲望。喜欢打破(🛋)砂锅问到底(🔳)，就是7号人。
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END
8号人
8号人责任感强、有梦想、注重权力，享受权威(🕹)感，他们是一类特别讲诚信的人(⏯)，对(⛵)待事业或(🎈)家庭责任(⏺)，也(🎄)尽职尽责。
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END
9号人
9号人智慧、(⛪)正直(🐎)、友(🌺)善(🗓)，兴趣爱好(🔸)广泛、(🛤)谈资丰富，无论(💹)在(👵)哪里都很(🐠)容易获得好感，是(👴)个交际高手。
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获取一个基因CDS序(🍕)列的方法如下：
打开NCBI（(🏛) https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下图，按照顺序(🛏)，在1处选择(🌿)Nucleotide，在2处输(🍭)入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来(♟)结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选(🛌)（如果你要做(🍞)鼠源的就(❇)选Mus musculus，其他(🤒)种(📲)属选择(🎎)相应的名称即可进一(🥔)步(🔝)筛(🐏)选了）
然后第一条就是我们需要(🖱)的序列信(🌝)息，点击(🛳)进去，往(😅)下拉，直到看到CDS（如下图）(🔙)
点(🔪)击CDS，就出现了(🆔)下图中所示内容，其中加了底色的部(🏙)分序列便是我们需要(🎮)的序列了，可以看(🛑)到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止(👸)密码子。选中这段(🎳)序列复制即可。
由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物(🧚)并(🔏)没有多少选择的余地，甚至可以(🗒)参照上述原则简单(🏷)粗(🐃)暴(🐚)的(🤥)从正反(💆)向各选择(⛺)22个碱基左右(🕐)作为(🦄)引物，例(📡)如：!
正向(🆓)引(🥞)物序列与CDS相同，反向引(🏝)物序列与CDS互补。另外(👲)要注(💕)意的(📌)是写引物等序列(🔋)都是要5’到(🐀)3’的方向，一(🍤)般不会从(🍇)3’到5’，所以我们的CDS虽然没(🛷)有注明方(➿)向，但是其实也是5’到3’。
虽然可以(❗)这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此(💉)教大家使用一下引物设计的经典软(🏯)件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下图，首先(🎽)点击File->New->DNA Sequence，
然后点击空白处Ctrl V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们(🚪)复制的是什么样的(➡)序列就粘贴的什么(😽)样(🏒)的序列。
下面(🐇)的依次是“反向序列粘贴(🏗)”、“互补序列粘贴(🅰)”“反向互补序列粘贴(🔇)”。
点(🖇)击左上角的(♉)Primer，如下图(💦)，S=Sense，A=Antisense
如果对现(👮)在(🌆)的引物不满意，还可以点击(👆)Edit Primers编辑序列，如下图(📊)，我们(🖋)删(💤)除掉(🕥)末尾三个(🤦)碱基，之(🕙)后(🏮)需要(🕗)先点击(🔹)Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已(🧢)经(⏳)从(⛏)25个碱基变为22个碱(😊)基了。
最后点击(😾)Edit->Copy->Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘(🕧)贴也会自动变为5’到3’(🖍)的序列(🦎)。所以非常方(🥢)便。
这样我(🧛)们(🔊)PDCD1用于PCR的正反向(🧝)引(🥂)物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在(🍾)的引物就可以(🥂)送去合成了，但(🙆)是如果你想将其构建到载体上，那么我(💲)们(🏙)还要对其进行进一步的加工(➿)。
Primer 5的使(🍒)用
根据不同的目的，可以(📎)选择不同的载体，如过(🙊)表达（(😷)pcDNA 3.0）、敲(🥜)减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、(💲)病毒包装（pMSCV-puro）、(🚃)敲除（lentiCRISPR v2）等。下(⏮)面我们就以(👤)过表达载体(🎪)pcDNA 3.0为(🤶)例进行讲(🗨)解。
从(🚆)质粒图谱上可以看到多克隆位点(♿)有(🔱)多个酶切位点(👰)可以(🥉)选择，那是不是每个位点都可以用呢(🌫)？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的(🌘)基因）本身没有的酶切位(🏪)点！
所(👢)以我们还需(🐧)要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。
还是打(🔓)开Primer 5，然后(🍿)粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质(🏪)粒图谱(✊)选择多克隆位点的酶，双击即可到(🌮)3的框中，选好之后(👠)点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和(🈶)KpnI两个(🌙)酶切(♎)位点，所以这两个不可以选(🏴)，其他的都可以选(💴)。
不(🕛)过一般选(🐲)择常用好(🤭)用的最(🗞)好是实验(📲)室就有现成的那些酶了。比如我们(💏)选(💛)择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相(🏞)应的酶切位点了。
于是我(🕚)们得到如下引物(🗃)：
好了，我们现在就可(👿)以(🎻)将这些引物送去相应(📫)公司合成了。
质粒构建
终于到正(🤭)题了！
待引物合成之后，我(🚧)们用ddH2O将(⬜)其稀释到 100 μM 作为母液，取(💳)一(🏅)些稀释(🗓)到 10 μ(🍐)M 做下一步实验了。
首先我们P出目的(🏢)基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶(☔) 。反应体系及反应条件如(🏭)下图：
模板的(👞)获取
PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂(🦄)盒(🏫)回收。回收之后(📀)将其(🎼)双酶切(🏚)，同时需要酶切适(🍘)量载体。如果你使用的是(🌸)Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开(🏢)网址(🍠) http://t.cn/RVuwBVo 查询双酶切所用的最佳Buffer。
酶(🙉)切回收之后的片段进行连接，我使(📽)用的是(📠) Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：
现在的T4连接(🏦)酶(🔎)基本都是快(🏝)酶(🏛)，比如Thermo的这款(🚯)声称10 min就可以(🛍)连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切(👉)勿连接过(👢)夜！
连接完成之后便是转化(👪)，挑菌（单克隆），摇(🏿)菌抽提质粒，送去测序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取(⛴)RNA比较成熟的(🐐)方法便(🎨)是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是(🧙)比较稳(📑)定且广泛(🛐)应用的，当然现在一些国产的TRIzol类(😾)产品也能(💎)满足大部(🛌)分情况下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事(🎿)项及原理
注(🎡)意事项：(🧤)
1、RNA酶（RNase）非常(💸)稳定，是导致RNA降解最主要(⏱)的物质。它(🙋)在一些极端的条件可以(⛑)暂时失活，但限(🍴)制因(🍲)素去除后又(🕟)会迅速复性(😋)。用常(💑)规的高温高压蒸汽灭菌法(✏)和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛(🐋)存在于人的皮肤上(🎅)，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套(🌛)。RNase的(🉐)又(🔖)一污(🐓)染源是(👠)取液器(📹)，一般情(🐙)况下采用用DEPC配(🚝)制的(💤)70%乙醇擦洗(🖇)取液器的内部和外部。提取(🥇)RNA时使用(🤓)专门的RNase-free的枪头和(🏽)离心管(🎸)。
2、(🎌)TRIzol试剂(🛅)具(🌺)有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的(💩)清洁剂和(🤓)水(🚕)冲洗(🍕)！
溶液配方(🚥)及(🎀)原理：
1、(🚜)TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞(🔉)内(🌯)含物的同时保持RNA的完(🚙)整。其主要成(🐁)分(📽)是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白(⛎)、(💊)核酸物质(🎯)解聚(🦄)得到释放。异硫氰酸胍(🕑)，是一种(🔊)强(⏮)力的蛋(🎾)白质变性剂，可溶解蛋白质并(🍘)使蛋白质(🙅)二级结构消失，导致(🌭)细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
2、氯(🍳)仿：氯仿可增强TRIzol中(🏡)的8-羟基(🕕)喹啉对RNase的抑制作用(💰)。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上(🚐)层为水相，下层为有机(😔)相。苯(😨)酚为弱酸性，酸性条件下（一般为(🕗)Ph5.0）DNA和蛋白(🎰)质进入有机相，而RNA留在(🔸)水(⛹)相；反之亦(🍸)然，弱碱(🛶)性（Ph8.0）时DNA留在水相。
3、(🧡)异(🉐)丙醇、无水(👳)乙醇(🕵)、70%乙醇(🗒)：(🕯)异丙醇和乙醇能与水任(🥀)意比例(🏝)互溶，因此加(⬜)入异丙醇能够夺取RNA周(🥡)围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与(📤)RNase的活性基(⭐)团组(💡)氨酸的咪唑环反应而抑制(🔼)其活性。DEPC有毒(⚓)性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁(✂)是(🕝)最自由的(🤼)，谁也就是最优秀(👱)的，在(🔕)他们身上，才会有最大的美。
操作步骤
1、细胞破(😟)碎
A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样(🌏)品(🐋)的比例向打散的组(🏼)织块中加入(👖)TRIzol试(🔶)剂，样品的体积不(🥂)能超(🥃)过TRIzol体积的10%。
B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用(🔶)移液枪反(🐝)复吹吸数次。TRIzol试剂过少(⬇)会(🍻)导致DNA污染。
C、悬浮细胞：悬浮(😊)细胞离(❄)心收集后，直接按1 mL/5~10×(🔆)106个细胞（动物、植物或酵(🕓)母）的比例加(🌰)入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造(🥧)成mRNA的降解(〽)。
如果样品(🥪)中含有较多的蛋白、脂肪、(🙊)多(💚)糖或其(🥤)他细胞外(🤸)物(📍)质，如(🤣)肌肉、脂肪组织或植物(⛵)的块根等，可在2℃~8℃(🌤)，12000×g离心10 min去除这些物质。
关于TRIzol的用量，Invitrogen官方(👾)说明书中有建议用量：
一般情况(🉑)下(🐓)，根(⤵)据细(😓)胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅(🌃)供参考）(🎺)
2、氯(😓)仿抽提分层
加入TRIzol后，室温（(🏇)15℃(🕚)~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解(🦒)离。按(🎈)0.2 mL/1 ml TRIzol的比(🗾)例加入氯仿。盖紧管盖(😾)后(💝)剧烈摇晃15s，室(🕺)温静置2 3分(💆)钟。12000×(🍸)g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断(🔏)裂。离心(😚)后液体分为(🚥)三层，下层为(👪)红色的有机相（酚(🗑)-氯仿）(😐)，中间为白色的沉淀，上层为无色的水(🍨)相。RNA在(📀)上层水相中，水(🧕)相的体积约为加入(🌆)的TRIzol体积的(🛠)60%。
3、用异丙醇使RNA沉淀
将上层水相转移到一个(🌄)干净的1.5 mL管中，如需(🚓)提取DNA或蛋白质就保(🚹)存下层有机相。
加入与(🗜)水相等(🗒)体(🃏)积的异丙(🔢)醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在(🐦)远离(🚹)离(👵)心机轴心的管底，为无色胶状。
4、用乙醇洗涤去除残留的(💪)蛋白质(🥕)和无机盐
去除上(🎚)清后，用1 mL 75%乙醇（用(⏬)Rnase-free的水配制）(🌹)洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去(🌶)除上清后，将管(📣)子(😝)敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈(🥪)现半透明状。不要让(💯)RNA沉(🌏)淀变成(🏜)完全不透(🧑)明，那时RNA完(🛹)全干燥将会大大影响RNA的溶解(🥃)。根据(🌸)后续(💒)实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹(😗)吸数次后。
逆转录法合成cDNA
一般逆转录（也可称作反(㊙)转录）都有现成的试剂盒，只要大家按(🎐)照(🌲)试剂盒的说明书来(🍊)操作(⛴)，问题都不大，在(🕵)这里我就以TAKARA的逆转(🌹)录试剂盒为例稍(🏓)加(🙄)说明(⤴)。
Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序(🚖)列为5'-(P)NNNNNN-3'，特(🚖)点是产物量大，特(😥)异性差，适(📷)用于长(⏩)的或具有Hairpin构造的RNA。包(👜)括(♎)rRNA、(🦕)mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反(🐈)转录反应(🕘)都可使用本引物。
Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因(😑)而特异性好，但因(🏫)其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、(💍)真核生物的rRNA、tRNA以及(🗡)某些种类真核生(🙅)物的mRNA等(⛄)不具(📐)有Poly（A）Tail）。
两种引物可据实际情况使用一种，也可同时(🤹)使(🗯)用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因(⛓)时(🔩)，也可以使用(🛹)Specific Primer（PCR时(💊)的下游引(😵)物）作为反(🌡)转录(🆘)引物。
操作步骤
步(🍱)骤简(🍩)述如(💄)下：按照下图中1配(🏘)制溶液，然后65℃(🍟)处(🏐)理(🕙)后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。
连接产物(🎛)的转化
常用(🍧)的感受态(🎎)细(👖)胞有DH5α、BL21（DE3）、(📂)Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α(🏡)，可以自(😂)己制备也可以购买商业(㊙)化的感受态。
ABOUT Transformation
注意事项
1. 感受(🕑)态细胞要现用现(💕)融，刚刚融化(🛋)的感受态转(🚬)化效率最(🏁)高；
2. 避免反复冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要轻(👟)柔，不要用移液(🐴)器(🌎)猛烈吹吸；
4. 感受(🎙)态和连接(👌)产物（或质粒）(👠)用量(🤺)要适中，并(🔳)不是越多(🏍)越好。
操作步(🏆)骤
1. 取50 μL感受态细(🔦)胞置于冰上融化(🛂)；
2. 加(🏪)入5 μL连接产物（质粒(📻)一般只需用白色枪头沾(🤭)取一(🥚)下即可），混匀，置(🦂)于冰上静置30 min（此时应该打开水(😇)浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置(🍌)于冰上静置2 min；
4. 加入500 μL无菌的LB培养(🥤)基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇(🤨)床中培养(➕)1 h，使(🆖)细胞(🌖)复苏；
5. 连(🌞)接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取(➿)少量LB（50 μ(🎭)L左右），重悬(🐚)沉淀，全部均匀涂布于LB培养(🥠)板（需(🕧)含(🎪)相应抗生素(🧜)）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质(🤽)粒(🔽)：直接(📑)取20 50 μL涂于LB培(🐻)养板上培养即(👺)可。
质粒的小(🚈)量(🚔)提取
ABOUT 质粒抽(🐳)提
实验原理：
较常用的质(⏫)粒提取方法(🎧)有三种：(🏪)碱(🥁)裂解(🗳)法、煮沸法(🏹)和去污(😌)剂（(👋)如Triton和SDS）裂(🐝)解(🌬)法。前两种方法比较剧烈，适用于(🏖)较小的质粒（<15kb）。去(🐬)污(🏋)剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。
碱裂(🔜)解(🔖)法是一种应用(🍋)最(🏍)为广泛的制备质粒的方(🏚)法，其(🤫)原理(🐴)为：当细菌暴露于高pH值的(🔜)强(👽)阴离子洗涤剂中，会使细胞壁(🍢)破裂，染色(✏)体DNA和蛋白质(🆕)变性，将(🏻)质粒DNA释放到上清中(🐨)。
由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分(💅)子，后者为线状分子(🧕)。只(♿)要碱(💣)处理(🥀)的强(🔴)度和(🍯)时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会(🌜)再次形成。
在裂解过(🥦)程中，细(⤴)菌蛋白质、破裂(📊)的细(⛅)胞壁和变性(⛷)的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后(🎅)者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。
当(👎)用钾离子取代(🕰)钠离子时，这些复合物会从溶液(😶)中有效(🐺)地沉(⏬)淀下来。离心除去沉淀之后，就(🤥)可以从上清中回收复性的质粒(💚)DNA。
本方法采用Tiangen小提(🌜)中量试剂盒进(❌)行提取，其纯化系统是硅基(🕐)质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通(🧕)过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后(🕳)用低(🔟)盐缓冲液或水将质(✋)粒DNA从(🐿)硅基质(🖱)上洗脱下来。得到的质粒(🍧)可以用(⌛)于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等(🐔)分子生物学实验。
实验试(🔠)剂(🚾)（试剂盒试剂(🧐)配方(💏)不清楚，以下配(🍳)方见《分子克隆实验指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于(🍘)提(🔨)供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以(🥤)使悬浮后的大肠杆菌不(🥙)会(🚼)快速沉积到管子的底部；而(💩)EDTA 作为Ca2 和Mg2 等(✨)二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为(🕤)去除(🔻)质粒中混有的(👂)RNA，其不受(💖)EDTA的影响(🎵)。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在(💏)于加(🎼)入P3之后(🚥)是被其(🥫)包盖的细(🐩)菌蛋白，染色体(🔷)DNA一(💲)起作为沉(🌆)淀析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸钾(💫)，2 M 醋酸
原理：这一步的(🐳)K 置(🚸)换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na ，得(🐏)到PDS（(🔲)十二(📖)烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白(🎩)质结(🎌)合(🧛)，平均两个氨基酸上结合一个(💣)SDS分子，钾钠离子(🙌)置换所产(👠)生的(😤)大量(🐟)沉淀自然就(🥥)将(💃)绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色(🚷)体DNA也被PDS共沉(🐟)淀。而(🕛)醋酸用于中和(🍅)碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。
操作(📱)步骤
1、将过夜培(🌨)养的菌液（5-15ml）从摇床中取出(🧖)，并(😧)拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽(😨)量(🚌)吸除(😒)上清。若暂时不(🏵)提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存(📵)于4℃(🍦)（短时间）。
注意：如果菌液较(🙍)多时可(💊)以通(🐁)过几次离心将菌体沉(🕶)淀收集到一个离心管中。
2、柱平衡步(💌)骤：向吸附(🏥)柱中（吸(📳)附柱(🉐)放入(♟)收集管中）加入500μl的平衡(⛪)液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的(🎟)废(📭)液，将吸附柱重(⏲)新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。
注意：若柱子(🥞)放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。
3、向留有(📖)菌(🧗)体沉淀(💄)的离心管(🙃)中加入500μ(🐏)l溶(🍀)液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上(🛵) ) ，使(🏎)用移液器或涡旋振荡器彻底悬(⌛)浮(🔋)细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较(🔫)多，则(⬅)相应增加P1的用量（之后P2和P3的(🛅)用量也应成比例增加），并分到(💮)几个管子中分(🏖)别进行步(🈲)骤4和5的操作(👃)（不然P1 P2 P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时(🏼)可过同一个吸附(🐰)柱。
注(🌨)意：菌体量以(😼)能够充(🚒)分裂解为佳，过多的菌体裂(🤽)解不充分会降低(🔱)质(📤)粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌(🎥)沉淀(📄)，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解(🔤)，导致提取量和纯度偏低。
4、向(🎻)离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体(☔)充分裂解。由(🌓)于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也(🔪)不(🌺)可(🚚)过(🎙)短(🌲)，以免裂解不彻(🔅)底(🐟)。每管操作时间(❤)尽(🆔)量一致。
注(😺)意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基(😝)因组DNA 。此时菌(💽)液应(🍭)变得(👮)清亮粘稠，如果未(📉)变得清亮，可能由(💉)于菌体过多，裂解不彻底(🚂)，应减少菌体量。
5、向离心管中(🧀)加入(🐬)700μl溶液(🚈)P3（记得(🏒)冰上预冷），立即温和地上下翻转(🏯)6-8 次(👑)，充(👕)分(😦)混匀(🏼)，此(🚥)时会出现白色絮(🥂)状沉淀(🏣)。放置冰(🌄)上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心(🗄)10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次(🕎)过(🐲)柱，可将上清转移至新(🦁)的离心管中，以免沉淀(📃)飘(🎞)起。
注意：P3 加入后(🥕)应立即(🐋)混合，避(🛏)免产(🔳)生局部沉(✅)淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再(🌨)次(🕢)离心后取上清。
6、将上(🔀)一步收(🆗)集(🥌)的上清液分(😾)次加入吸附柱中(🐃)（(🤼)吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意(✴)尽量不要吸出(🔥)沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉(🎤)收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
7、可选步骤：向吸附(🆎)柱中加入500ul去蛋白液(🚼)PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新(🎢)放回收集管中。
注意(🛎)：(㊗)如果宿主(✅)菌是end A 宿(🐢)主菌(🗄)（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大(🐥)量的(🎼)核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步(💊)。
如果宿主菌(🥞)是(🔅)endA-宿主菌（(😫)DH5α，TOP10等），这步省略。
8、向吸附柱(⛏)中加入600μl漂洗液(💍)PW（请先检查是否已(📽)加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒(🤤)掉收(🗂)集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
注意：(🥧)加入漂洗液PW后(🚒)，如果(♋)室(🕞)温静置2-5 min，有助于(🔥)更(🎖)好地去除杂质。
9、重复操作步(🆑)骤8。
10、(🐛)将(🌂)吸附(⭐)柱重新放回收集管中置(🎹)于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液(🏍)去除(🏹)。
注意：漂洗液中乙醇的残留(😎)会影(🔠)响后(🐆)续的酶(🚑)反应（酶切、(🌏)PCR 等）实验。为确(🙍)保下游实(🥏)验不(🎡)受残留乙醇的(🗻)影(🉐)响(😒)，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数(🌧)min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附(💱)柱置于一个(🐪)干净的离(🎸)心管中，向吸(👼)附膜的中间部位悬(😃)空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预(👌)热），室温放置或65℃(🤽)水浴(🌈)2 min，12000rpm（-13400g ）(🏳)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：为(⛩)了增加质粒的回(💿)收效率，可将得到的溶(💹)液重新加入(📹)离心吸附柱中．(👈)重复步骤
11、洗脱液的(💴)pH 值对于洗脱效率有很(🚖)大影响。若用(💖)水(🤑)做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围(🥫)内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效(🔍)率。洗脱缓冲液(➿)体(👠)积不应少于100μl，体积过(🍊)小影响回收效率，但也不应过大，以免所(👭)提(🤨)质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防(👴)DNA 降解。
结(🥚)果判断
1、使(🍙)用(⛽)紫外分光光度(🏐)计对质粒浓度(😽)及纯度(🥇)进行测定
（1）(📻)检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为(🌳)1相当于大约50μg/ml；(🌯)纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能(🏙)是蛋白质污(💽)染，偏高则(🤽)可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使(👥)用洗脱(🆚)缓冲液，而使用去离子(🧛)水，比值会偏(🔩)低，但并(🌷)不表示纯度低，因(🕊)为pH值和离子存在会影响(🌗)光吸收值。另外，测(🏿)出来的OD260和OD280都应该(🏻)在0.1-2.0之间(⛓)，不(🌗)然所得出(🥒)的浓度和(🍫)纯度不准确。
（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品(♑)管(💞)一样（如样品为2μl所提质粒 48μl ddH2O，则(👌)blank为2μl洗脱液 48μl ddH2O）。
2、酶切鉴定，并用琼脂糖(🚭)凝胶(🌦)电泳检测
（1）选用合适的内切酶对所提质粒(🍄)进行酶切，并与未切质粒及转(🤛)化用原质粒一起(😇)用琼脂糖凝胶(🗜)电泳检测(🔩)，根据酶切结果及所提质粒与(🈳)原质(🔞)粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为(📅)目的质(📀)粒。
（2）所提(❤)质粒（未酶切）的电泳条(🏅)带可能为一条带，也可能为(🏠)二到三(🤞)条带，这(🛏)是因为(👶)质粒(📖)提(⛏)取(🙀)过程中(🤕)操作过于剧烈可能使环状超螺(💌)旋结构的质粒DNA单链出现缺(📄)口（保持环(🚀)状(🤖)，失去(🈁)超螺旋(🙄)），或双链(🔊)断裂（变(😪)成(📊)线状），三种构型的质(🕜)粒分子在琼脂糖凝胶电泳(🌛)中的迁移(🌱)速率(➖)是不一样的，因(🙅)此会出现多(🔞)条带，这也(🐐)说明所得(❤)质粒不够(🐛)理想。
测序(🤠)结(👟)果(😩)的(🚺)分(🍐)析(🌚)
构建好质粒之(➗)后我们一般先酶切鉴定，鉴定(🌦)正确的可以直接(🕙)拿去转染(🐿)然后做WB检测表达(😍)即可(😢)。
可以(💘)正常表达的质粒我(🏮)们需要送到测序公司测(🍙)序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还(🏩)服务（即送菌液(💎)返还他们抽提的(🌓)质(💜)粒）。
测序的引物一般使(🐒)用通用引物，如果(😵)没有通用(🚵)引物需要自行设(😦)计。常用的通用(🐻)引物如下：
在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！
测序(🧖)结果返回之后我们就可以(📺)分析测(🤲)序结(🥛)果了。
一般(🏌)常(💭)用的序列比对软(🚞)件有DNAMAN和(👀)Chromas，当然(😞)，还有很多类似软(🧒)件，大(🙊)家可以根据个(🆑)人习惯选择，在这(😖)里(🥈)就不一一(🚇)介(🈁)绍了。
DNAMAN
1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的(🌂)编(🕳)号，每个通(🀄)道只(🚦)能载入一个序(🏒)列(🐾)：
2. 然后点击File->New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl A全(🙋)选，右(🏎)键(🏘)选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。
3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File->Open打开(🦗)测序回来的序列信息(🌃)（后缀为.seq）(🦄)，同(⚡)样全选右键载入通道2，之后点击Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在弹出窗口(😋)中，点击(⬇)Channel，选中(🍜)需要比对序列的通道，点击OK即可：
5. 后面基本(💠)是(🏉)一直点击下(🤳)一步(🚇)，在如(🖥)下图窗口(💏)中选中Try both strands：
6. 然后一(🛬)直下一步，出来如(🤪)下结果，即可比(🥪)对测序结果和原CDS序列，如果有突(🐝)变我(🗿)们需要看一下(🌵)是否是同义(🙄)突变，如果是即质粒序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软件打开测序返还的(📙)序列信息(🕘)，然后点击File->Blast Search:
